Restriksiyon Endonükleaz Enzimleri


Büşra Pilekoğlu - Başkent Üniversitesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik, Lisans Öğrencisi


Restriksiyon endonükleaz (RE) enzimleri, kısa DNA dizilerini özgül olarak tanıyan ve bu dizilimlere yakın bölgelerden veya bu dizilimler içindeki spesifik bölgelerden DNA’yı kesen yapılardır. Günümüzde 300’e yakın farklı DNA dizilimini tanıyan yaklaşık 3000’den fazla restriksiyon endonükleaz varlığından söz edilmektedir. RE enzimlerinin çok büyük bir kısmı bakterilerden, çok az bir kısmı da virüs ve ökaryotlardan izole edilmiştir.


1965’te Arber; DNA metilasyonunun bakteriyi restriksiyon ajanlarına karşı koruduğunu ortaya çıkarmıştır. Bakteri, kendi DNA’sını kendi endonükleazlarından korumak için metiller, demiştir.


1968’de Meselson ve Yuan; ilk RE’ı E.coli bakterisinden izole etmişlerdir. Fakat bu RE’ın spesifik tanıma bölgesi bulunmamaktaydı.


1970’de Smith ve Wilcox; H. influenza’dan spesifik DNA sekansını tanıyan ve kesim yapan bir endonükleaz (Hind II) izole ettiler.

RE’ların doğal biyolojik fonksiyonu, bakteriyel savunma mekanizmasında oynadıkları roldür. Bakteriye giren yabancı DNA’ları da kesebildiklerinden, intraselüler bakteriyel patojenleri inaktive edebilmekte ve bakteriyi virüslerden ve yabancı DNA’lardan korumaktadırlar.Aynı zamanda, bakterilerde bulunan spesifik metilaz enzimleri de, restriksiyon bölgelerine metil grupları ekleyerek, RE’ların bakterinin kendi DNA’sını kesmesini engellemektedir.


RE’lerin isimlendirmesinde önce enzimin elde edildiği bakteri cinsinin ilk harfi, daha sonra bakteri türünün ilk iki harfi ve son olarak da soya ait bir harf ile ilk izolasyondan başlayarak Romen rakamı ile enzimin izolasyon sırası belirtilir. Restriksiyon endonukleazlar çift iplikcikli DNA da yaptıkları kesimlerin özelliklerine göre başlıca 3 gruba ayrılmaktadırlar.


Örneğin EcoRI enzimi için;

E=cins(Escherichia) co=tür(coli) R=suş(RY 13) I=Bu mikroorganizmadan izole edilen ilk RE olduğunu belirtir.


1970’li yıllardan sonra restriksiyon endonükleaz kullanımına bağlı olarak rekombinant DNA teknolojisi hızla gelişmiş ve bu gelişme seçilen bir genin ilen bir genin çoğaltılmasını, genin kodladığı proteinin, genin diziliminin belirlenmesini vb.mümkün hale getirmiştir. Bu teknolojideki merkezi konumu nedeniyle, RE enzimleri özellikle klonlama çalışmaları yapan araştırma laboratuarlarında sıklıkla kullanılmıştır. RE kullanım alanlarına örnekler:


Rekombinant DNA elde edilmesi DNA haritası çıkarılması polimorfizmlerin belirlenmesi probların hazırlanması DNA modifikasyon durumlarının analizi RE’lar DNA tanıma bölgesi ve katalitik alan olmak üzere iki fonksiyonel alt birimden oluşmaktadır.DNA tanıma bölgesi spesifik bölgeyi tanır ve katalitik alanı buraya yerleştirir.Tanıma sekansına yerleşen katalitik alan heliksin fosfodiester bağlarını kırar.


RE’lar sadece bazlar arasında yatay konumda bulunan fosfodiester bağlarını kırarlar.Karşılıklı iki baz arasındaki hidrojen bağlarının kesilmesinden sorumlu değildirler. Hidrojen bağları, fosfodiester bağlarının kırılmasıyla ve çözeltideki termal hareketten doğan enerjinin etkisiyle kendiliğinden kırılırlar.


Bazı R.E.’lar, DNA’nın 2 ipliğini birden tanıma bölgesinin ortasından keserler ve küt uçlar oluşur.Bazıları ise çift zincir DNA’yı aynı pozisyondan kesmezler, uç bölgedeki bir zincir, diğerine göre uzun olabilir; bunlar da yapışkan uçlardır ve birbirlerine bağlanma eğilimindedirler. Farklı tanıma bölgelerine sahip 2 enzim, 2 aynı yapışkan uç oluşturabilir.


RE’lar için substrat olan spesifik veya nonspesifik çift zincir DNA sekanslarına tanıma sekansları denilmektedir. Restriksiyon tanıma bölgelerinin uzunluğu değişebilmektedir. Farklı RE’lar aynı tanıma sekansına sahip olabilirler. Aynı sekansı tanıyan ve farklı organizmalardan elde edilmiş RE’lara izoşizomer denir. İzoşizomerler aynı sekansı tanımalarına karşın, kesimi sekansın farklı bölgelerinden de yapabilirler. Bunlara ise neoşizomerler denir.


RE’lar gerek uzun süreli saklanırken gerekse aktivite gösterirken uygun şartlara ihtiyaç duymaktadırlar. Bir enzimden en iyi şekilde yararlanabilmesi için gerekli şartlar üretici firmalar tarafından kullanıcıya bildirilmelidir. RE’larla çalışırken, bu şartlara uyulmadığı takdirde sıkça problemlerle karşılaşılır.Enzimlerin star aktiviteleri, DNA ve enzim konsantrasyonunun uygun olmaması, pH ve iyonik dengenin uygun olmaması, çalışılan enzimin diğer enzimlerle kontaminasyonu gibi problemler uygun olmayan kesimlere neden olabilmektedir.


RE’ların Sınıflandırılması


RE’lar; metilaz aktivitelerine, alt ünite yapılarına, kesim özgüllüklerine ve kofaktör ihtiyaçlarına göre sınıflandırılmışlardır.


Tip I RE’lar: Endonükleaz aktiviteleri için ATP,S-adenozilmetionin ve Mg+2’a ihtiyaç duyarlar.Bilinen tüm tip I RE’lar tanıma sekansındaki adenin rezidülerini metilasyona uğratmaktadır.Bu enzimler tanıma sekanslarına bağlanmalarına rağmen, kesimleri sekans dışında tesadüfi olarak gerçekleştirmektedirler. 3 altüniteden oluşurlar. Birincisi, tanıma sekansını tanır; ikincisi, adenin rezidülerini metiller; üçüncüsü ise kesimden sorumludur. Tip II RE’lar: RE’lar denildiğinde ilk akla gelen ve en çok çalışılan gruptur.İzole edilen RE’ların çok büyük kısmı bu gruptadır.Çünkü tip II RE’lar, tam hedef nükleotitten veya çok yakınından kesim yapma özellikleri nedeniyle araştırmalar için ideal enzimlerdir.Mg+2 iyonlarının varlığında çift zincir DNA üzerindeki palindromik sekansları tanır ve bu sekans içindeki özel bölgeden kesim yaparlar. Kesimleri ATP’ye bağlı değildir. Restriksiyon fragmanları ve jelde band paternleri oluşturmaları bakımından diğer tip RE’lara göre çok üstündürler ve hemen hemen sadece bu grup RE’larla çalışılmaktadır. Tip III RE’lar:Tip I RE’lar gibi metilasyon modifikasyon fonksiyonuna sahip olup, Mg+2 ve ATP’ye bağlı kesim gerçekleştirirler. Çok altüniteli enzimlerdir ve tam bir kesim yapma özellikleri zayıftır. DNA’ya tanıma sekanslarından bağlanmalarına rağmen, kesimi tanıma bölgesinden farklı bir yerden gerçekleştirirler. Homing endonükleazlar: Protein yapıları bakımından diğer RE’lardan farklılık gösteren, uzun ve asimetrik bölgeleri tanıyıp kesen, aktivitesi için protein ve RNA’ya ihtiyaç duyan enzim grubudur.Daha az tanıma özgüllüğü göstermekte ve tanıma bölgelerindeki tek baz değişimlerini tolere edebilmektedirler. Nicking endonükleazlar: RE’lar çift zincir DNA’ya bağlanıp kesim yaparlar. Tek zincire bağlanıp endonükleaz aktivitesi gösteren enzim grubuna da “nicking ” endonükleazlar denilmektedir.






Kaynakçalar:

https://acikders.ankara.edu.tr/pluginfile.php/7196/mod_resource/content/0/6.%20Hafta.pdf

https://prezi.com/_frs0e4oh_o7/resktirksiyon-enzimleri-siniflandilmasi-cesitleri-ve-kesme-m/

http://yunus.hacettepe.edu.tr/~mergen/sunu/s_restrictions.pdf

1,411 görüntüleme

Türkiye'nin Tek Popüler Genetik Bilim Dergisi

Bezelye Dergi ISSN: 2587-0173

Bizi Takip Et
  • Beyaz Facebook Simge
  • Beyaz Instagram Simge
  • White Twitter Icon
  • Icon-gmail
  • kisspng-white-logo-brand-pattern-three-d
  • images
  • medium
  • Dergilik
  • YouTube

© 2019 by Bezelye Dergi