Ames Testi
Esengül Öztürk - Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi
Günümüzde “genotoksisite testleri” olarak adlandırılan, canlı sistemlerindeki gen mutasyonları ve kromozom hasarları gibi değişikliklerin tanımlanmasında ya da genetik hasara sebep olan kimyasalların belirlenmesinde çeşitli testler kullanılmaktadır. Bu testlerden biri olan Ames testi, gen düzeyinde meydana gelen mutasyonların tespit edilmesinde kullanılan oldukça yaygın bir test olarak karşımıza çıkmaktadır[1].
Kısaca Ames olarak adlandırılan Ames /Salmonella /Mikrozom testi 1973 yılında Bruce Ames ve ekibi tarafından geliştirilmiş olup, kolay uygulanabilirliği ve güvenilir sonuçlar elde etme gibi özellikleri sayesinde mutajenite araştırmaları için kısa zamanda, uygulanabilir testler arasında yer almıştır[1]. Ancak Ames test sistemine ilk defa 1967 yılında Brezilya’da hummaya neden olan Aedes aegypti adlı sivrisineğindeki organik fosforlu bir pestisit türü Temephos’un mutajenite araştırmalarıyla başlanmıştır[2].
Çeşitli kimyasallar sonucu oluşan bu mutasyonlar hücre genomuna ait DNA dizisindeki kalıcı hasara neden olan değişikliklerdir. Yapılan çalışmalarda genotoksik maddelerden bazılarının çeşitli hastalıklara yol açtığı tespit edilmiştir. Örneğin, Benzen yaygın olarak bilinen bir toksindir ve ara ürünlerinden biri olan 1-4-benzokinon (BQ), miyelodisplastik sendrom (MDS) ve akut miyeloid lösemi (AML) gibi kanser türleri için bir risk faktörü olarak kabul edilmektedir. Bir diğer örnek ise, bitkilerde ortak bileşenler olarak bilinen, kemirgenlerin bitkilerdeki besinleri ısırması, dışkısını bırakması gibi çeşitli temaslar sonucu ortaya çıkan ve insan hastalıklarıyla ilişkili olan pirolizidin alkaloidleridir. Bu alkaloidlerin özellikle DNA hasar çeşitlerinden biri olan G: C → T: A transversiyon mutasyonuna neden olduğu belirlenmiştir[3].
Ames testi, genellikle Salmonella bakteri suşlarının kullanıldığı bir yöntemdir. Bu test mutasyonlu, histidin sentezleme yeteneği olmayan His- bakterilerine, histidin yeteneği kazandıran bir mutasyonun etkisine dayanır. Bakterilerin bu dönüşümü sayesinde mutajenik etkisi olduğu tahmin edilen kimyasal bileşenin genotoksisite seviyesi hakkında net bir bilgi elde edilmesini sağlar[4].
Bakterilerin genetik yapısındaki değişikliğe sebep olan bu kimyasallar, hücre duvarlarından giriş sağlamaktadır. Ancak Salmonella typhimurium, gram negatif bir bakteri olduğu için hücre duvarının dış kısmında lipopolisakkarit yapılı (LPS) bir tabaka bulunmaktadır. Bu tabaka sayesinde hücre içerisine kimyasal madde geçişi engellenmektedir[5].
Ames testinde kullanılan Salmonella bakteri suşlarının özellikleri şu şekildedir:
Şekil 1: Yaygın olarak kullanılan Salmonella test suşlarının genotipik özellikleri[5].
Günümüzde yapılan araştırmalarda genellikle HisG46 ve HisD3052 genlerinin mutasyona uğradığı TA98 ve TA100 suşları kullanılmaktadır. HisG46, histidin sentezinde sırasında kullanılan ilk enzimi kodlayan gende oluşan bir mutasyon iken, HisD3052 yine histidin sentezinde histidinol dehidrogenaz enzimi kodlayan gende oluşan mutasyondur[5].
Rfa mutasyonu ise bakterilerdeki LPS tabakasını kodlayan genlerde meydana gelen bir mutasyon çeşididir. Bu tabaka yapısının azalması durumunda bakteri mutajenlerine karşı hassasiyeti azalır. Böylece hücre içerisine mutajenlerin girişi oldukça kolaylaşır[4,5].
Şekil 2: Salmonella typhimurium ile yapılan Ames testi[4].
Ames testinin deney basamaklarına bakıldığında test edilen kimyasal bileşene ve bileşenin alındığı organizmaya göre farklılık göstermedir. Ancak genel olarak test aşamaları şu şekilde sıralanabilir:
1-Salmonella Typhimurium bakterilerinden His¯ suşları izole edilir.
2-Suşlarda test edilen kimyasal sonucu açığa çıkan metabolik ürünlerin mutajenik olup olmadığını tespit etmek için (mikrozomal enzim ekstresi) S9 Fraksiyonu içeren ve S9 fraksiyonu içermeyen olmak üzere iki ayrı grup belirlenir.
3-Her iki gruba da bakteri kültüründen, ve test maddesinden eklenir. S9’lu gruba ayrıca S9 karışımı eklenir. ve plakalara dökülerek inkübasyonu yapılır.
4-Pozitif ve negatif grupları da hazırlanarak tüplerdeki karışımlar agarlı plaklara aktarılır ve inkübasyonu yapılır.
5-İnkübasyon süresi sonunda plaklardaki His+ kolonileri sayılır[6,7].
Ames testinin avantajlarına bakıldığında ise, özellikle teknolojinin henüz yeterince gelişmediği yıllarda, tüm ülkelerde uygulanabilir bir yöntem olarak yer almıştır. Bunun sebebi, düşük teknolojili, hızlı ve kolay ve taşınabilir olmasıdır[1].
Geçtiğimiz yüzyıldan bu zamana kadar, insanlardaki kalıtsal hastalıkların veya çeşitli mutasyonlar sonucu oluşan kanser türlerinin önlenmesi amacıyla genotoksikoloji alanında farklı test sistemleri tasarlanmış, bu testler sayesinde de insan sağlığında önemli rol oynayan kimyasal ajanların mutajenik etkileri tespit edilmiştir. Ames testi ise, kolaylığı ve güvenirliği sayesinde hâlâ birçok genotoksik çalışmada potansiyel bir test olarak kullanılmaya devam etmektedir.
Referanslar
1.Zeiger, Errol. 2019. “The Test That Changed the World: The Ames Test and the Regulation of Chemicals.” Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis.
2. Aiub CAF, Coelho ECA, Sodré E, Pinto LFR, Felzenszwalb I. Genotoxic evaluation of the organophosphorous pesticide Temephos, Genetics and Molecular Research. 2002;1(2): 159-166.
3. Ren, Ning, Manar Atyah, Wan Yong Chen, and Chen Hao Zhou. 2017. “The Various Aspects of Genetic and Epigenetic Toxicology: Testing Methods and Clinical Applications.” Journal of Translational Medicine.
4. Karadaş, Şakire. 2018. “Determination of Mutagenic Effects of Schiff Bases Containing Azo-Chromophore.” Kahramanmaraş Sütçü Imam University.
5. Efecan, Hatice. 2014. “Determination of Mutageni̇c Activity of Halfenprox by Using Ames Test.” Afyon Kocatepe University.
6. Yoshida, Edson Hideaki, Natália Tribuiani, Giovana Sabadim, Débora Antunes Neto Moreno, Eliana Aparecida Varanda, and Yoko Oshima-Franco. 2016. “Evaluation of Betulin Mutagenicity by Salmonella/Microsome Test.” Advanced Pharmaceutical Bulletin. doi: 10.15171/apb.2016.057.
7. Fowler, Kathy, Wanda Fields, Victoria Hargreaves, Lesley Reeve, and Betsy Bombick. 2018. “Development, Qualification, Validation and Application of the Ames Test Using a VITROCELL® VC10® Smoke Exposure System.” Toxicology Reports. doi: 10.1016/j.toxrep.2018.04.003