Bakteriyosinler, Kullanım Alanları ve Etki Mekanizmaları

---

Ebrar Güneş – Moleküler Biyoloji ve Genetik, İstanbul Teknik Üniversitesi

---

Bakteriler alan, besin gibi etkenler için rekabet içerisindedirler. Bu rekabet için birçok mekanizmaya sahiptirler. Bu mekanizmalardan bir tanesi de bakteriyosinlerdir. Bakteriyosinler ile ilk kez 1925 senesinde E. coli tarafından salınan colicin’in tespiti ile tanışılmıştır.[1] Bakteriyosinler bir tür antimikrobiyal peptidlerdir. Bakteriyosinler hücre içerisinde sentezlendikten sonra aktivite gösterecekleri bölgelere, hücre dışına taşınırlar.[2] Yoğunluklu olarak Gram pozitif bakteri türlerini etkileseler de Gram negatif bakterileri etkileyen türleri de vardır. Patojen bakterilere ya da yiyeceklerin bozunumunu sağlayan bakterilere de etki gösterdiği için gıdaların korunmasında diğer koruyucu maddeler ile birlikte kullanılır. Gıda korunumu için çoğunlukla laktik asit bakterileri tarafından üretilen bakteriyosinler kullanılmaktadır. Bakteriyosinlerin gıda korunumu için kullanılması biyolojik temelli bir koruma yöntemi olduğu için kimyasal ve ısıl işlemlere karşın besin içeriği açısından daha zengin, daha az asidik ve tuz içeriği sağlar. Gıda sektörü haricinde bakteriyosinler ilaç ve kozmetik sektöründe de etkin olarak kullanılmaktadır. Bunlara ek olarak, özellikle patojen bakteriler için hibrit ve genetiği değiştirilmiş bakteriyosinler üzerine çalışılmaktadır.[3] Antibiyotiklere alternatif olarak bakteriyofajlar, bakteriyosinler ve başka metotlar üzerinde aktif olarak çalışılmaktadır.

Bakteriyosinler antimikrobiyal peptid oldukları için yapısal olarak 4’e ayrılırlar. Bunlar amfipatik ɑ-sarmal yapı, β yaprak yapı, uzatılmış doğrusal ve karışık peptid zincir yapılarıdır.[4]

Şekil 1: Antimikrobiyal peptitlerin yapısal çeşitleri.

Bakteriyosinlerin Sınıflandırılması

Bakteriyosinler sınıflandırılırken diğer bakterileri öldürme yöntemlerine (gözenek oluşturması, nükleaz aktivitesi, peptidoglikan üretimini engellemesi), genetik özelliklerine (büyük plasmid, küçük plasmid kromozomal), moleküler ağırlıklarına ve kimyasal özelliklerine (büyük protein, peptit, şeker kısmı olan/olmayan, lantiyonin gibi amino asit içeren) ve üretim yöntemlerine (ribozomal, ribozomal üretim sonrası modifikasyonlar, ribozomal olmayan) göre sınıflandırılırlar.[5]

Sınıf I

Yapılarında “lantiyonin” amino asidi bulunduğu için lantibiyotikler olarak adlandılırlar.[6] Lantiyonin’in yanı sıra metillantiyonin amino asit türevlerini içeren türler de vardır. Lantibiyotikler modifikasyon açısından diğer bakteriyosin gruplarına göre en kapsamlı modifikasyonu geçirir. Sınıf I kendi içerisinde A ve B olmak üzere ikiye ayrılır.[5]

• Sınıf IA

Hidrofobik polipeptit yapıdadırlar. Katyonik ve membran aktif peptitlerdir. Fermantasyon işlemi sırasında Gram pozitif laktik asit bakterileri tarafından sentezlenirler. Sınıf IA, bakteriyosinler arasında en çok kullanılan bakteriyosini barındırır, Nisin. Nisin’i Loctococcus lactis bakterisi üretir. Nisin lantiyonin, metillantiyonini didehidroalanin ve didehidroaminobütirikasit dahil olmak üzere 34 amino asit domainine sahiptir.[5]

Şekil 2: Sınıf IA üyesi Nisin’in birincil yapısı[7]

Bu yaygın olmayan amino asitler, öncül peptitlerin translasyon sonrası modifikasyon yolu ile peptit zincirine dahil edilir. Nisin geniş nir inhibasyon spekturumuna sahiptir. Etkisiz duruma getirdiği bakteri türleri, laktik asit bakterileri gibi gıda bozulmasına bağlı Gram pozitif bakteriler ve Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus ve Clostridium botulinum gibi patojen bakterilerdir. Nisin, 1988 yılında Genel Olarak Güvenli (GRAS) statüsüne layık görülmüştür. Amerika Birleşik Devletleri'nde ve kırktan fazla ülkede gıdalar için doğal biyo-koruyucu olarak kullanılmaktadır. Avrupa'da Nisin, E234 E kodu ile bilinir. Nisin, ürünün rengini, aromasını, kokusunu ve tadını etkilemeden süt ürünlerinde, konserve gıdalarda, meyve sularında, alkollü içeceklerin bazılarında, et ürünlerinde ve fermente gıdalarda kullanılır. Nisin ayrıca Streptococcus pneumoniae, Enterococci ve Clostridium difficile gibi çoklu ilaç direncine sahip bakteri suşlarının büyümesini önleyebileceğini göstermiştir.[8] Şaşırtıcı başka araştırmalarda ise Nisin’in tümörlerin büyümesini inhibe edebileceği gösterilmiştir.[9] Özetle, Nisin geniş bir uygulama yelpazesine sahiptir.[5]

• Sınıf IB

En çok kullanılan üyesi Mersacidin, Bacillus cinsi bakterilerden üretilir. Mersacidin, Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi’nden (FDA) onay alamamış ve Genel Olarak Güvenli (GRAS) statüsüne layık görülmemiştir. Bundan dolayı gıda uygulamaları için kullanılmamaktadır. Mersacidin’in en önemli kullanım alanı, Staphlococcus aureus’a karşı kullanımıdır. Nisin ve antibiyotiklere kıyasla çok düşük konsantrasyonlarında dahi Staphylococcus aureus’a karşı hücre duvarı stres tepkisini güçlü bir şekilde uyardığı gözlemlenmiştir. Metisilin dirençli Staphlococcus aureus’a karşı kullanımı bu benzersiz veriminden ötürü onaylanmıştır.[10]

Sınıf I katyonik lantibiyotikler, elektrostatik kuvvet yoluyla bakteriyel anyonik fosfolipid membrana bağlanır ve peptidin N-terminal bölgesi ile membran arasındaki etkileşim oluşur. Bu alan, hücre membranındaki Lipid II ile bir bağlantıya izin verir. Lipid II bakteri hücre duvarının sentezinde yer alan bir öncü moleküldür. Lantibiyotiklerin Lipid II’ye bağlanması ile peptidoglikan sentezi kesintiye uğrar. Membran geçirgenliği dengesizleşir, gözenek oluşumu gözlemlenir ve iyon dengesi bozulur, tüm bunlarının sonunda bakteri ölüme sürüklenir.[11]

Şekil 3: Nisin ve Mersacidin’in Gram pozitif bakterilere karşı etki mekanizmaları.

Sınıf II

Bu gruptaki bakteriyosinler Sınıf I’den farklı olarak lantiyonin içermezler. Antimikrobiyal aktiviteleri, membran aktif olmalarından kaynaklanmaktadır. Hidrofobik ve / veya amfifilik bölgeler içerirler. 4 alt sınıfa sahiptir, bu alt sınıflar A, B, C ve D’dir.

• Sınıf IIA

Pediosin PA-1, bu sınıfın en çok çalışılan bakteriyosinidir. Pediococcus acidilactici’den üretilir. Gıda bozucu bakterilere ve Listeria, Bacillus, Clostridium ve Staphylococcus cinsi gibi gıda kaynaklı patojenlere karşı kullanılabildiği için bir gıda biyo-koruyucusudur. N-terminal bölgesinde pediosinlere özgü YGNGYV (sırasıyla, tirozin, glisin, asparjin, glisin, tirozin ve valin) ve C-terminal bölgesinde de hidrofilik ya da amfifilik yapılar içerir. Pediosin PA-1 etki mekanizması, Gram pozitif bakterilerin sitoplazmik membranı üzerindedir. Gözenek oluşturarak hücreyi ölüme sürükler. Geniş pH aralağında aktiflik gösterebilmesi, termostabil özellik göstermesi ve bazı protein parçalayan enzimlere karşı direnç göstermesi gibi benzersiz özelliklere sahiptir.[12,13]

• Sınıf IIB

Lactococcin G, Lactococcus lactic suşlarından elde edilir ve Lcn-ɑ ve Lcn-ß olmak üzere iki modifiye edilmemiş katyonik peptidden oluşur. Bundan ötürü iki peptitli bakteriyosin adı ile de bilinir.[14] Bu iki polipeptitin primer yapıları birbirinden farklıdır ve her ikisi de hidrofobik ve/veya amfifilik bölgeler içerir. Ayrı ayrı aktivite gösterebildikleri gibi, hedef bakteriyi hasara uğratabilmeleri için eşzamanlı çalışmaları gerekmektedir. Eşzamanlı çalıştıklarında transmembran gözenek oluştururlar ve potasyum iyonlarının hızlı salınması nedeniyle hedef hücrelerde iyon dengesizliğine neden olurlar.[5]

Şekil 4: Lactococcin G yapısı ve etki mekanizması. İki katyonik lipitten, Lcn-ɑ ve Lcn-ß oluşur.[15]

• Sınıf IIC

Dairesel katyonik lipitlerdir. Bakteriyosinlerin bu dairesel özelliği, diğer doğrusal bakteriyosinlere kıyasla antimikrobiyal aktiviteyi ve stabiliteyi artırmıştır. Bu verimli antimikrobiyal aktivite ve stabilite, bu bakteriyosinin hedef bakterinin sitoplazmik membranına yerleşmesine ve gözenek oluşmasına sebep olmaktadır. Enterococcus faecalis’ten üretilen Enterocin AS-48 bu sınıfın en bilindik bakteriyosinidir. Enterocin AS-48’in Gram negatif bakterilerin hücre dış zarlarını etkisiz hale getirebildiği gösterilmiştir. Escherichia coli ve Salmonella enterica’nın Gram negatif bakterilerine Enterocin AS-48’in etkisi kimyasal koruyucularla kombinasyon edildiği zaman artılmış olunur. Enterocin AS-48'in bir gıda biyo-koruyucu olarak potansiyel uygulamaları, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli ve Salmonella enterica patojenlerine karşıdır.[5]

Şekil 5: Sınıf IIC üyesi Enterocin AS-48’in etki mekanızması. Bakteriyosin hedef bakterinin membranına yerleştirilir ve hücre ölümüne yol açan hücre zarı geçirgenleşmesine neden olur.[5]

• Sınıf IID

Bu bakteriyosin sınıfı yüksek asidite ve yüksek sıcaklık koşulları altında stabil antimikrobiyal peptitlerdir ve protein parçalayan enzimlere karşı dirençlidirler. Bu sınıfın en iyi örneği Aureocin A53’tür. Aureocin A53, Staphylococcus aureus A53 tarafından üretildiği için bu ismi almıştır. Bu bakteriyosin hedef hücrelerin membranında gözenek oluşturmaktan ziyade membran bozulması yoluyla membran geçirgenliğini etkilemektedir. Aureacin A53, Listeria monocytogenes’e ve Staphylococcus aureus gibi patojenlere antimikrobiyal aktivite gösterir. Gıda koruyucu ve antibiyotiklere alternatif olarak kullanılır ve ilaç biyoteknolojisinde potansiyel uygulamalara sahiptir.[16]

Sınıf III

Bu bakteriyosinler yüksek moleküler ağırlığa sahiptirler ve ısıya karşo kararsız büyük proteinlerdir. Bu sınıf ikiye ayrılmıştır, A ve B. [17]

• Sınıf IIIA

Bu sınıfın örneklerinden biri olan Lysostaphin, hedef bakterinin hücre duvarını yapısındaki peptidoglikanı bozan proteinleri parçalama yeteneği olan bir enzimdir. Lysostaphin, Gram pozitif bakteri olan Staphylococcus simulans’tan üretilir. Lysostaphin, Staphylococcus aureus ve Staphylococcus epidermis’e karşı etkili bir bakteriyosindir. Her iki bakter, de biyofilm* oluşturma yeteneğine sahiptir. Lysostaphin’in vankomisin gibi yaygın kullanılan antibiyotiklere kıyasla bu bakterilerin biyofilmlerini bozma yeteneği daha verimlidir.[5]

• Sınıf IIIB

Bu sınıfın örneklerinden olan Helveticin J bakteriyosini Lactobacillus Helveticas’tan üretilir. Helveticin J, protein parçalayan enzimlere ve yüksek sıcaklığa duyarlıdır. 30 dakika boyunca 1000 C’ye maruz kalırsa deaktive olur. Hedefi olan Gram pozitif bakterilerin hücre duvar yapılarını ve sitoplazmik iç zarlarını borazak hücre içeriğinin dışarıya sızmasına neden olur. Hedefi olan Gram negatif bakteri hücrelerinin dış zarını hücre ölümüne yol açacak şekilde bozar.[5]

Sınıf IV

Bu sınıf diğerlerine göre yeni tanımlanmış bir sınıftır. Bu sınıftaki bakteriyosinler, lipit veya karbonhidrat kısımları içeren kompleks bakteriyosinler olarak tanımlanırlar. Bu sınıfta Sublancin ve Glycocin F tanımlanmıştır. Sublancin, Bacillus subtilis’ten üretilen bir glikopeptittir. Sublancin, Staphylococcus aureus suşlarına karşı antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğu gözlemlenmiştir. Glikosin F, Lactobacillus plantarum tarafından üretilir, çok çeşitli Gram pozitif bakterilere karşı antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğu gözlemlenmiştir.[5]

Geleneksel olarak kullanılan antibiyotikler ve bakteriyosinler arasında temel 2 farklılık mevcuttur. Bu farklılıklar, bakteriyosinler genellikle dar spektrumda antimikrobiyal aktivite gösterirlerken antibiyotikler geniş spektruma sahiptir. İkinci fark ise, bakteriyosinler, birincil metabolit olarak sentezlenirken, antibiyotikler ikincil metabolit olarak sentezlenmektedir. Birincil metabolitler doğrudan büyüme, gelişme ve üremeyle doğrudan ilişkiliyken, ikincil metabolitler bu işlemlere doğrudan dahil değildir. Ancak genellikle önemli bir ekolojik işleve sahiptir.[18]

Özet olarak, insan nüfusunun artmasıyla doğru orantılı olarak artan besin ihtiyacının karşılanması gerekir. Bu gıdaların karşılanabilmesi için de birçok faktör önemlidir, bu faktörlerin bir tanesi gıdanın korunmasıdır. İnsanlar gıdaları korumak adına fiziksel, kimyasal ve biyolojik yöntemler keşfetmişler/geliştirmişlerdir. Bakteriyosinler de bu keşiflerden bir tanesidir. Bakteriyosin kullanmak, diğer yöntemlere göre az işlem gerektirmesi ve doğal katkı maddesi oluşu yönünden avantajlıdır. Özellikle gıda sektöründe büyük yer kaplayan bakteriyosinlerin kullanılmadan önce bakterilerin bakteriyosinlere gün geçtikçe daha fazla direnç kazandığı unutulmadan temkinli yaklaşılmalıdır.

*Biyofilm yapısını öğrenmek için Elif Şenkuş’un Bezelye Dergi’deki blog yazısını okuyabilirsiniz. (https://www.bezelyedergi.net/post/y%C3%BCzeylerdeki-mikroorganizma-topluluklar%C4%B1-biyofilmler)

Referanslar

1. Gratia J. P. (2000). André Gratia: a forerunner in microbial and viral genetics. Genetics, 156(2), 471–476.

2. Kuleaşan H. Çakmakçı M. L. (2003). Bakteriyosinlerin özellikleri, gıda mikrobiyolojisinde kullanım alanları ve ileri dönemlerdeki kullanım potansiyelleri. Gıda, 28(2): 123-129.

3. Johnson, E. M., Jung, D. Y.-G., Jin, D. Y.-Y., Jayabalan, D. R., Yang, D. S. H., & Suh, J. W. (2017). Bacteriocins as food preservatives: Challenges and emerging horizons. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 1–25. doi:10.1080/10408398.2017.1340870

4. Lee, T.-H., N. Hall, K., & Aguilar, M.-I. (2015). Antimicrobial Peptide Structure and Mechanism of Action: A Focus on the Role of Membrane Structure. Current Topics in Medicinal Chemistry, 16(1), 25–39. doi:10.2174/1568026615666150703121700

5. Ibrahim, O.O. (2019) Classification of Antimicrobial Peptides Bacteriocins, and the Nature of Some Bacteriocins with Potential Applications in Food Safety and Bio-Pharmaceuticals. EC Microbiol. 15, 591–608

6. Willey, J. M., & van der Donk, W. A. (2007). Lantibiotics: Peptides of Diverse Structure and Function. Annual Review of Microbiology, 61(1), 477–501. doi:10.1146/annurev.micro.61.080706.093501

7. Shin, J. M., Gwak, J. W., Kamarajan, P., Fenno, J. C., Rickard, A. H., & Kapila, Y. L. (2016). Biomedical applications of nisin. Journal of applied microbiology, 120(6), 1449–1465. https://doi.org/10.1111/jam.13033

8. Shin, J. M., Gwak, J. W., Kamarajan, P., Fenno, J. C., Rickard, A. H., & Kapila, Y. L. (2016). Biomedical applications of nisin. Journal of applied microbiology, 120(6), 1449–1465. https://doi.org/10.1111/jam.13033

9. Joo, N. E., Ritchie, K., Kamarajan, P., Miao, D., & Kapila, Y. L. (2012). Nisin, an apoptogenic bacteriocin and food preservative, attenuates HNSCC tumorigenesis via CHAC1. Cancer medicine, 1(3), 295–305. https://doi.org/10.1002/cam4.35

10. Kruszewska, D., Sahl, H. G., Bierbaum, G., Pag, U., Hynes, S. O., & Ljungh, A. (2004). Mersacidin eradicates methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in a mouse rhinitis model. The Journal of antimicrobial chemotherapy, 54(3), 648–653. https://doi.org/10.1093/jac/dkh387

11. Duraisamy, S., Balakrishnan, S., Ranjith, S., Husain, F., Sathyan, A., Peter, A. S., … Kumarasamy, A. (2020). Bacteriocin—a potential antimicrobial peptide towards disrupting and preventing biofilm formation in the clinical and environmental locales. Environmental Science and Pollution Research. doi:10.1007/s11356-020-10989-5

12. Rodríguez, J. M., Martínez, M. I., & Kok, J. (2002). Pediocin PA-1, a wide-spectrum bacteriocin from lactic acid bacteria. Critical reviews in food science and nutrition, 42(2), 91–121. https://doi.org/10.1080/10408690290825475

13. Anastasiadou, S., Papagianni, M., Filiousis, G., Ambrosiadis, I., & Koidis, P. (2008). Pediocin SA-1, an antimicrobial peptide from Pediococcus acidilactici NRRL B5627: production conditions, purification and characterization. Bioresource technology, 99(13), 5384–5390. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2007.11.015

14. Nissen-Meyer, J., Oppegård, C., Rogne, P., Haugen, H. S., & Kristiansen, P. E. (2010). Structure and Mode-of-Action of the Two-Peptide (Class-IIb) Bacteriocins. Probiotics and antimicrobial proteins, 2(1), 52–60. https://doi.org/10.1007/s12602-009-9021-z

15. Oppegård, C., Emanuelsen, L., Thorbek, L., Fimland, G., & Nissen-Meyer, J. (2010). The lactococcin G immunity protein recognizes specific regions in both peptides constituting the two-peptide bacteriocin lactococcin G. Applied and environmental microbiology, 76(4), 1267–1273. https://doi.org/10.1128/AEM.02600-09

16. Netz, D. J., Bastos, M., & Sahl, H. G. (2002). Mode of action of the antimicrobial peptide aureocin A53 from Staphylococcus aureus. Applied and environmental microbiology, 68(11), 5274–5280. https://doi.org/10.1128/aem.68.11.5274-5280.2002

17. Oscáriz, J.C., Pisabarro, A.G. (2001). Classification and mode of action of membrane-active bacteriocins produced by gram-positive bacteria. Int Microbiol 4, 13–19. https://doi.org/10.1007/s101230100003

18. Cotter, P. D., Ross, R. P., & Hill, C. (2013). Bacteriocins - a viable alternative to antibiotics?. Nature reviews. Microbiology, 11(2), 95–105. https://doi.org/10.1038/nrmicro2937