Bradford Protein Assay
Yaşar Yurtsever – İstanbul Teknik Üniversitesi, MBG
Bradford assay 1976 yılında Marion M. Bradford tarafından geliştirilmiştir. Bradford testi bir solüsyon içindeki protein konsantrasyonunu ölçmeyi sağlayan çok hızlı ve verimli bir test yöntemidir. Genellikle 470 nm dalga boyuna sahip ‘coomassie brillant blue G-250’dan oluşur ve solüsyon içindeki protein miktarına göre gittikçe koyulaşan bir mavi renk verir. Genel anlamda coomassie brillant blue G-250, solüsyonlar içerisindeki proteinlere bağlanarak 470 nm dalga boylu mavi renge dönüşür.[1,2,3] Farklı metotlar farklı dalga boylarında renk verebilirler ve ayrıca verimleri de farklıdır. Örneğin, UV assay 280 nm, Bicinchoninic acid 562 nm ve Lowry metodu 750 nm dalga boylu renkler ile oluşturulur.[2]
Sadece Bradford sıvısını dökerek protein solüsyonu üzerinde gözle görülebilir ve tahmin yapılabilecek seviyede renk değişimleri gözlenebilir ve farklı solüsyonlar ile konsantrasyon miktarı karşılaştırılabilir. Bunun haricinde spektrofotometre kullanılarak net bir şekilde protein konsantrasyonu miktarı hesaplanabilir. Spektrofotometre basitçe ifade edecek olur isek ışık kaynağı ve lenslerin bulunduğu kısım ve detektör ve veriyi işleyen kısım olmak üzere 2 ana kısımdan oluşur. Belirli bir ışık kaynağından gelen ışınlar genel anlamda monokromator adı verilen içinde prizma bulunan ve kaynaktan gelen ışınların çeşitli dalga boylarına ayrılmasını sağlayan bir yapı ve ışını küvet adı verilen, içinde dalga boyunun ölçülmesinin istendiği solüsyonların bulunduğu kaplar içine yönlendiren çeşitli lensler bulunur ve ayrıca bu absorbe edilen ve yansıtılan ışınların dalga boylarını ölçen detektörler bulunur.[4,5]
Şekil 1. Bradford sıvısı solüsyon içindeki protein miktarına göre renk değiştirir. Soldan sağa protein konsantrasyonu artmaktadır.[6]
Solüsyon içerisindeki net protein konsantrasyonunu elde edebilmek için genellikle bovine serum albumine (BSA) ile saf su (dH2O) veya fosfat buffer solüsyon (PBS) kullanılarak bir solüsyon oluşturulur ve konsantrasyonunun ölçülmesi istenen madde ile karıştırılarak bir çözelti elde edilerek oluşturulur.[7]
Örneğin, herhangi bir toprak veya sıvı içerisinde sadece protein olup olmadığı bakılmak istenirse eğer saf suda çözülmüş toprak örneği yüzeyinden alınan çamurlu su veya sıvı ise normal şekilde Bradford sıvısını karıştırıp renk değişimi olup olmadığına bakmak yeterlidir.
Eğer spektrofotometrik analiz için Bradford testi yapılıyor ise o zaman çözeltinin yaklaşık olarak 5 dakika inkübe edilmesi gerekir yani Bradford sıvısının mümkün olan her proteine bağlanabilmesi için bekletilmesi gerekir ve daha sonra spektrofotometre altında analiz edilebilir hale gelir. Spektrofotometre için bir referans solüsyonu oluşturulur ve diğer kısmına da ölçülmek istenilen solüsyon konarak ölçüm gerçekleştirilir. Ancak, eğer sadece protein olup olmadığına bakılmak istenir ise solüsyonun içine Bradford dökülüp karıştırılarak bu çok kısa bir süre içerisinde gözlemlenebilir hale gelecektir.[6]
Toprak haricinde spektrofotometre ve Bradford gibi protein konsantrasyonu ölçebileceğimiz metotlar laboratuarlarda da genellikle çeşitli protein analizleri, enzim aktivitelerinin ölçülmesi, enzim kinetiği çalışmalarında ve hücre kültürlerinin yoğunluklarını incelerken sıkça kullanılır. Hali hazırda enzimin aktivitesine göre ortaya çıkan ürün miktarları ve benzeri şeyler bu şekilde incelenebilir.
Bradford haricinde farklı assay varlığında da benzer testler yapılabilir. Örneğin, Biüret, Bradford, Kjendahl, Lowry, Smith, and Warburg-Christian gibi testler kullanılarak da protein konsantrasyonları ölçülebilir. Ancak, her testin kendine özgü avantajları ve dezavantajları olduğu için bu testlerin mevcut ihtiyacı karşılar şekilde seçilmesi önemlidir. Bradford testi 5 dakika gibi bir sürede net bir şekilde hazır olabilirken aynı şekilde protein konsantrasyonuna bakmak için kullanılan Bicinchoninic Acid Assay (BCA) metodu 60 ’de 30 dakika bekletilmesi gerekir [8] veya başka bir örnek olarak Lowry protein konsantrasyonu ölçüm metodu Bradford metoduna göre daha güvenilir sonuçlar verebilmektedir.[9]
Referanslar
[1]: Jones, C., Daniel Hare, J., & Compton, S. (1989). Measuring plant protein with the Bradford assay. Journal of Chemical Ecology, 15(3), 979-992. doi: 10.1007/bf01015193
[2]: Johnson, M. (2012). Protein Quantitation. Materials and Methods, 2. doi: 10.13070/mm.en.2.115
[3]: Majorek, K., Porebski, P., Dayal, A., Zimmerman, M., Jablonska, K., & Stewart, A. et al. (2012). Structural and immunologic characterization of bovine, horse, and rabbit serum albumins. Molecular Immunology, 52(3-4), 174-182. doi: 10.1016/j.molimm.2012.05.011
[4]: NasrAzadani, R., Mehvari, A., & Tavakoli, M. (2019). Design and Manufacturing of Spectrophotometer for Diagnosis of Icterus and Diabetes. Majlesi Journal of Mechatronic Systems, 8(4), 19-24. Retrieved on 15 May 2020, from http://journals.iaumajlesi.ac.ir/ms/index/index.php/ms/article/view/422
[5]: John C.Hall, "Gordon C.Sauer. Manual of Skin Diseases". 7 th ed. Philadelphia, New York: Lippincott- Raven.
[6]: Bradford assay colours (2020). [Image] Retrieved on 18 May 2020, from https://www.eiroforum.org/wp-content/uploads/pg-embl-03.jpg
[7]: Shouren Ge, Kojio, K., Takahara, A., & Kajiyama, T. (1998). Bovine serum albumin adsorption onto immobilized organotrichlorosilane surface: Influence of the phase separation on protein adsorption patterns. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, 9(2), 131150. doi: 10.1163/156856298x00479
[8]: Walker, J. M. (2009). The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook, 11–15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
[9]: Okutucu, B., Dınçer, A., Habib, Ö., & Zıhnıoglu, F. (2007). Comparison of five methods for determination of total plasma protein concentration. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 70(5), 709–711. doi: 10.1016/j.jbbm.2007.05.009