beyaz logo.png

CAR T-Hücre Tedavisinde CRISPR/Cas9 Uygulamaları


 

Besne Çelik - Moleküler Biyoloji ve Genetik, Afyon Kocatepe Üniversitesi

 

Kanser immünoterapisi, cerrahi, kemoterapi ve radyoterapiden sonra dördüncü ana tedavidir. Adoptif T hücre immünoterapisi, özellikle kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücre tedavisi, özellikle Kymriah ve Yescarta'nın FDA onayından sonra kanser tedavisinde devrim yaratmaktadır (B hücreli lösemi ve lenfomada CD19'a yönelik CAR T hücreleri) [1–3]. CAR'lar, tipik olarak, antikordan türetilen bir hedef bağlayıcı hücre dışı alan, bir menteşe bölgesi, bir transmembran alanı ve T hücrelerini aktive edebilen bir hücre içi sinyalleşme parçası içeren sentetik reseptörlerdir [4,5]. CAR'larla programlanmış T hücreleri, majör histo-uyumluluk kompleksi (MHC) kısıtlaması olmaksızın antijen eksprese eden hücreleri çok özel olarak tanıyabilir ve öldürebilmektedir. Klinik veriler, CAR T-hücre tedavisinin, çeşitli hematolojik ve katı kanserleri olan hastalarda, özellikle nükseden/refrakter akut lenfoblastik lösemide (ALL) ve çarpıcı yanıt oranları yüzde 80 ila 100 arasındadır[6-8]. CAR T hücre tedavisinin umut verici etkinliğine rağmen, otolog T hücrelerinin yetersiz miktarı ve kalitesi, CAR T hücresinin tükenmesi ve tümör baskılayıcı mikro ortamlar, potansiyel kendi kendini öldürme ve kontrol edilemeyen çoğalma gibi çözümleri bekleyen çeşitli zorluklar vardır.


CAR T tasarımlarının optimizasyonunun, bu sınırlamaların üstesinden gelmenin ana yollarından biri olduğu varsayılmaktadır. Yalnızca CD3 zeta hücre içi zincirine sahip ilk nesil CAR T hücrelerinin orta düzeyde proliferatif ve sitotoksik kapasiteye sahip olduğu bulunmaktadır[9-12]. İkinci nesil CAR'lar, gelişmiş bir etkinlik ve in vivo hayatta kalma elde ettiği kanıtlanmış tek bir ortak uyarıcı alan (CD28 veya 4-1BB) içerirken, üçüncü nesil iki veya daha fazla ortak uyarıcı alana (CD28, 4-1BB, ICOS veya OX40) sahiptir ve ikinci nesilden üstün değildir[13-15]. Potansiyeli artırmak için interlökin genleri, T-hücre ticaretini iyileştirmek için kemokin reseptör genleri ve güvenlik ve kontrol edilebilirliği artırmak için açma-kapama anahtarları veya intihar genleri gibi yeni nesil CAR'lara daha fazla fonksiyonel elementin eklendiği düşünülmektedir[16-18].

Genomik düzenleme teknolojilerinin geliştirilmesi, dördüncü nesil CAR T hücrelerinin hızlandırılması için bir pencere açmaktadır. Şu anda çinko parmak nükleazları (ZFN'ler), transkripsiyon aktivatör benzeri efektör nükleazlar (TALEN'ler) ve kümelenmiş düzenleyici aralıklı kısa palindromik tekrar/CRISPR ile ilişkili protein 9 (CRISPR/Cas9) dahil olmak üzere üç ana genomik düzenleme teknolojisi vardır[19–21]. ZFN'ler ve TALEN'ler, klinik deneylerde T hücrelerini tasarlamak için uygulanmış olsa da, hedeflenebilir DNA dizilerinin tanınması, karmaşık protein konformasyonuna, bir çift Zn-parmak bağlama alanına veya bir çift TALE DNA bağlama alanına, karmaşık tasarımlara ve eşlik eden bir çift TALE DNA bağlama alanına dayanmaktadır [22,23]. Küçük bir kılavuz RNA (sgRNA) tarafından hedef bölgeye yönlendirilen CRISPR/Cas9, basitliği, esnekliği, yüksek verimliliği ve çoğullaşabilir genom düzenleme yetenekleri nedeniyle bu araçların en popüler ve geliştirilmişi haline gelmektedir[24–26]. Bir sgRNA-güdümlü Cas9 nükleazı, hedeflenen genomik lokasyonlarda DNA çift sarmallı bir kırılmayı indükler, ardından homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya homolojiye yönelik onarım (HDR) ile onarılmaktadır. Hataya meyilli bir onarım yolu olan NHEJ, küçük nükleotid dizilerinin eklenmesi veya silinmesi ile sonuçlanabilir ve HDR, ilgili bölgede bir homoloji onarım şablonu varlığında nispeten büyük gen segmentlerini devre dışı bırakabilmektedir[27-29]. Bu nedenle, CRISPR/Cas9 teknolojisi ile kombinasyon, T-hücre mühendisliğinin alanını daha da genişletecektir. Yeni nesil CAR T hücrelerini üretmek için interlökinler ve intihar genleri gibi fonksiyonel genlerin devre dışı bırakılmasının yanı sıra, diğer stratejiler, 'kullanıma hazır' evrensel olarak geliştirmek için TCR'ler ve MHC'ler gibi endojen genlerin devre dışı bırakılmasını içermektedir[30]. CAR T hücreleri, baskılayıcı mikro ortamları iyileştirmek için inhibitör reseptörlerin (PD-1 ve TGF beta reseptörü gibi) bozulması [31,32], CAR kasetinin spesifik gen lokusuna (TRAC ve TET2 gibi) entegrasyonu ve verimliliği ve güvenliği artırarak [33,34], CAR T hücrelerinin kendi kendini öldürmesini önlemek için hedef genlerin silinmesidir [35].

Allojenik Evrensel CAR T Hücrelerinin Üretimi

Şu anda yaygın olarak kullanılan otolog CAR T hücreleri kanser tedavisinde umut verici sonuçlar gösterse de, sınırlamalar mevcuttur. Kayıtlı hastaların yaklaşık %10-15'i, üretim için uygun olmayan düşük kaliteli ve yetersiz miktarda otolog T hücresi veya hızlı hastalık ilerlemesi ve hatta belirli miktarda CAR T hücresinin başarılı bir şekilde üretilmesinden önce ölüm nedeniyle CAR T hücrelerinin infüzyonlarını alamamaktadır [1 –3]. Bir UPenn ekibi yakın zamanda, anti-CD19 CAR T hücrelerinin, anti-CD19 CAR'ı anormal şekilde eksprese eden anti-CD19 CAR T hücrelerinin infüzyonundan sonra nükseden bir hasta bildirdi, çünkü CAR geni, T-hücresi üretimi sırasında kasıtsız olarak tek bir lösemik B hücresine dahil edilmektedir[36 ]. Sağlıklı donörlerden evrensel 'kullanıma hazır' CAR T hücrelerinin geliştirilmesi, kısıtlamaları aşabilir ve potansiyel olarak gelecekte ana akım yön olabilir. Bu tür evrensel CAR T hücre ürünlerinin başlıca engelleri, graft-versus-host hastalığı (GVHD) ve infüze edilen allojenik T hücrelerinin reddidir. Adaptif olarak transfer edilen donör lenfositleri üzerindeki endojen αβ T hücre reseptörleri (TCR'ler), insan lökosit antijeni (HLA) uyumsuz alıcılardaki alloantijenleri tanıyarak GVHD ile sonuçlanabilir; tersine, donör T hücrelerinde yabancı HLA moleküllerinin tanınması reddedilmeye yol açabilmektedir.


ZFN'ler ve TALEN'ler, CAR aracılı sitotoksisiteden ödün vermeden GVHD'yi önlemek için TCR-negatif CAR T hücreleri oluşturmak üzere TCRa sabitini (TRAC) ve TCRβ sabitini (TRBC) nakavt etmek için başarıyla kullanılmaktadır[37,38]. Önceki araştırmalar, TRAC veya TRBC lokuslarının genetik nakavtının, T hücre yüzeyinde αβTCR ekspresyonunu ortadan kaldırmak için yeterli olduğunu göstermiştir [39]. Cellectis ilk olarak, TRAC ve CD52 genlerinin nakavt edildiği TALEN tarafından düzenlenen allojenik evrensel anti-CD19 CAR T(UCART19) hücrelerinin neslini bildirdi [40]. CAR T hücrelerinde CD52 bozulması, bir anti-CD52 antikoru (alemtuzumab) kullanılarak hastaların otolog T hücrelerinin etkili hedefli tükenmesine izin vermektedir. Ürünlerin insanda ilk uygulaması, UCART19 hücrelerinin infüzyonunu aldıktan sonra moleküler remisyona ulaşan ve başarılı bir köprüden transplantasyona ulaşan yüksek riskli CD19-pozitif ALL'li iki bebekti [41,42]. Dikkat çekici sonuçlar, UCART19 hücrelerinin iki klinik denemesine yol açtı: yetişkinlerde CALM denemesi ve pediatrik hastalarda PALL denemesidir (NCT02746952 ve NCT02808442). 20 hastadan oluşan birleştirilmiş veriler, %15 (3/20) şiddetli sitokin salınım sendromu (CRS) ve %10 (2/20) G1 kutanöz akut GVHD ile kabul edilebilir ve yönetilebilir güvenlik ve ayrıca %88 (14/ 16) CR veya CR ile eksik kan sayımı geri kazanımı (CRi) ve %86 (12/14) minimal rezidüel hastalık negatiftir[43]. Bir MSKCC grubu, CD19'a özgü bir CAR'ın CRISPR/Cas9 teknolojisi kullanılarak TRAC lokusuna yönlendirilmesinin, yalnızca insersiyonel onkogenez ve TCR ile indüklenen GVHD risklerini en aza indirmekle kalmayıp, aynı zamanda T-hücresi potensini ve gecikmiş T-hücre yorgunluğunu da arttırdığını göstermektedir[33] .


ZFN'ler ayrıca klinik deneylerde reddetmeden kaçınmak için kullanılan birincil ve genetiği değiştirilmiş insan T hücrelerinde HLA-I ekspresyonunu kalıcı ve tamamen ortadan kaldırmak için HLA-A lokusunu hedeflemek için kullanılmaktadır[44]. Ek olarak, HLA-I kompleksinin polimorfik olmayan alt birimi olan HLA ağır zincirlerinin veya beta-2-mikroglobulinin (B2M) ortadan kaldırılması, allojenik hücrelerin hızlı reddini önleyecektir[45]. Bununla birlikte, ideal evrensel CAR T hücreleri, in vivo kalıcılığı ve sitotoksisiteyi azaltmadan GVHD ve reddi önlemek için hem TCR hem de HLA'yı susturmalıdır. CRISPR/Cas9, ZFN'ler ve TALEN'ler ile karşılaştırıldığında aynı anda multipleks ve yüksek verimli genomik düzenlemede bariz bir avantaja sahiptir. CRISPR/Cas9, preklinik çalışmalarda vahşi tip anti-CD19 CAR T hücreleri kadar benzer güvenlik ve etkinliğe sahip çift devre dışı bırakılmış (B2M ve TRAC, DKO) UCART19 hücreleri oluşturmak için kolayca uygulanabilmektedir[30]. Çoklu gRNA kasetlerini tek bir CAR lentiviral vektörüne dahil ederek multipleks genom düzenlemesi için tek seferlik CRISPR protokolü, DKO UCART19 hücreleri oluşturmak için geliştirilmiştir [46]. Cas9'u kodlayan RNA ve endojen TCR ve B2M'yi aynı anda hedefleyen gRNA'ları birlikte tanıtmak için CAR'ın lentiviral teslimatını CRISPR RNA elektroporasyonu ile birleştirerek, güçlü bir antitümör olarak gösterilen DKO UCART19 hücrelerini oluşturmak için geliştirilmiş bir düzenleme verimliliği (~% 80) elde edilmektedir. Hem in vitro hem de hayvan modellerinde gen düzenlemeli olmayan CAR T hücreleri olarak aktiviteler [47]. Ancak bu tür HLA-I negatif CAR T hücrelerinin NK hücrelerinin hedefi olup olmayacağı konusu düşünülmelidir. Bir anti-NK hücre tükenme antikorunun uygulanması veya HLA-E ile T hücrelerinin mühendisliğinin yapılması, NK aracılı reddin üstesinden gelmek için potansiyel çözümlerdir[48].


Engelleyici Sinyal Moleküllerinin Bozulması


T hücrelerinin işlevinin, CAR T hücrelerinin terapötik etkisinde önemli ölçüde önemli bir rol oynadığı kanıtlanmıştır[49]. Bununla birlikte, malign tümörleri olan hastalarda T hücreleri kalıcı antijene maruz kalır ve bu da T hücresi tükenmesine neden olur[50]. Tükenmiş T hücreleri, güçlü efektör fonksiyonlarını kaybeder ve programlanmış hücre ölümü 1 (PD-1), sitotoksik T-lenfosit antijen 4 (CTLA-4), alan içeren protein-3 (TIM-3) ve lenfosit gibi çoklu inhibitör reseptörleri ifade etmektedir. T-hücre proliferasyonunu ve sitokin üretimini inhibe eden ve immün kaçışa yol açan aktive gen-3 (LAG-3) [51]. İnhibitör yollar ayrıca katı tümörlerde CAR T hücre tedavisinin ana bariyeri olan baskılayıcı tümör mikro ortamına da katkıda bulunmaktadır. Bağışıklık kontrol noktası inhibitörleri, anti-PD-1/PD-L1 ve anti-CTLA-4 antikorları umut verici klinik sonuçlar göstermiş ve FDA tarafından onaylanmıştır[52]. Bu nedenle, çoklu inhibitör faktörlerin bozulmasının, CAR T hücrelerinin gücünü artırması beklenilmektedir. Son çalışmalar, TRAC/TRBC, B2M ve PD-1 genlerinin CRISPR aracılı üçlü nakavtına sahip anti-CD19 CAR T hücrelerinin in vitro ve hayvan modellerinde DKO UCART19 hücrelerinin aksine daha güçlü antitümör fonksiyonları sergilediğini ileri sürmektedir [30, 47]. Tek seferlik platforma sahip yüksek kaliteli Cas9'lar, dörtlü genlerin aynı anda bozulmasıyla PD-1 ve CTLA-4 ikili inhibitör yolak dirençli DKO UCART19 hücrelerinin üretilmesinin fizibilitesini göstermiştir [46].


Fas reseptörü, hücre ölümüne aracılık eden tümör nekroz faktörü α (TNF-α) ölüm reseptörleri ailesinin bir üyesidir[53]. Araştırmalar, CAR T hücre aktivitesinin, hücre Fas-FasL'ye bağlı aktivasyona bağlı hücre ölümü (AICD) nedeniyle zayıflatıldığını göstermiştir[54]. Ayrıca AICD direncinde artış ve uzun süreli hayatta kalma gözlemleyen Fas'a dirençli evrensel CAR T hücreleri oluşturmak için CRISPR/Cas9 teknolojisini kullanılmaktadır.


Dönüştürücü büyüme faktörü-β (TGF-β), ilgili reseptörlerin heterodimerizasyonunu ve majör TGF-β sinyal aracıları SMAD2 ve SMAD3'ün fosforilasyonunu indüklemek için TGF-β reseptörlerini (TGFBRI ve TGFBRII) bağlayarak efektör T-hücre aktivitelerini baskılamaktadır[55]. TGF-β ayrıca T hücre farklılaşmasını düzenleyici T hücrelerine (Treg'ler) yönlendirilmektedir[56]. Bu nedenle, çeşitli katı tümörlerde güçlü bir immünosupresif faktör olan TGF-β sinyalinin inhibe edilmesi, immünosüpresif ortamı iyileştirme potansiyeline sahiptir. Önceki çalışmalar, TGF-β yolunun, aşağı akış sinyali için gerekli hücre içi alandan yoksun bir baskın-negatif TGFΒRII (dnTGF-βRII) kullanılarak bloke edilebileceğini göstermiştir[57]. dnTGF-βRII eksprese eden insan antijenine özgü sitotoksik T lenfositleri (CTL'ler) oluşturmak için klinik dereceli bir retrovirüs vektörü kullanmış ve TGF-β-dirençli CTL'lerin, TGF-β-salgılayan lenfomada modifiye edilmemiş CTL'lere göre fonksiyonel bir avantajı olduğunu bulmuşlardır[31]. Klinik deney (NCT00368082), TGF-β-dirençli CTL'lerin Hodgkin lenfomalı hastalarda lenfo-tüketici kemoterapi olmaksızın güvenli bir şekilde genişleyebileceğini ve kalıcı olabileceğini ve tam yanıtları indüklediğini göstermektedir [58]. PSMA-hedefli insan CAR T hücrelerine dnTGF-βRII eklenmesinin, T-hücre proliferasyonunu ve artmış prostat kanseri eradikasyonunu desteklediği kanıtlanmıştır [59]. Chang ve ark., yakın zamanda TGF-β-nötralize edici antikorların sekanslarına dayalı bir scFv içeren yeni bir TGF-β CAR tanımladı, bu sadece endojen TGF-β sinyalini inhibe etme yeteneğini değil, aynı zamanda TGF-β'yi T-hücre büyümesinin bir uyarıcısına dönüştürme yeteneğini de göstermektedir [ 60].





Referanslar

1. Neelapu, S.S., Locke, F.L., Bartlett, N.L.(2017). “Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma.” N Engl J Med,377(26):2531–44.

2. Maude, S.L, Laetsch, T.W., Buechner, J.(2018). “Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia.” N Engl J Med, 2018;378(5):439–48.

3. Schuster, S.J, Bishop, M.R, Tam, C.S. (2019). “Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma.” N Engl J Med, 380(1):45–56

4. Guedan S, Calderon H, Posey AD. (2019). “Engineering and design of chimeric antigen receptors.” Mol Ther Methods Clin Dev, 12:145–56.

5. Kulemzin, SV., Kuznetsova, V.V., Mamonkin M. (2017). “Engineering chimeric antigen receptors. Acta Nat, 9(1):6–14

6. Fry T.J, Shah, N.N, Orentas RJ. (2018). “CD22-targeted CAR T cells induce remission in B-ALL that is naive or resistant to CD19- targeted CAR immunotherapy. Nat Med, 24(1):20

7. Adaniya, SPS, Cohen, A.D, Garfall, AL.(2019). “Chimeric antigen receptor T cell immunotherapy for multiple myeloma: a review of current data and potential clinical applications.” Am J Hematol, 94:S28–33.

8. Raje N, Berdeja J, Lin, Y. (2019). “Anti-BCMA CAR T-cell therapy bb2121 in relapsed or refractory multiple myeloma.” N Engl J Med, 380(18):1726–37.

9. Sadelain, M., Brentjens R, Riviere I. (2009). “ The promise and potential pitfalls of chimeric antigen receptors.” Curr Opin Immunol, 21(2):215–23.

10. Brocker, T., Karjalainen K. (1995). “Signals through T cell receptor-zeta chain alone are insufficient to prime resting T lymphocytes.” J Exp Med, 181(5):1653–9

11. Kershaw MH, Westwood JA, Parker, L.L. (2006). “A phase I study on adoptive immunotherapy using gene-modified T cells for ovarian cancer.” Clin Cancer Res, 12(20):6106–15.

12. Till BG, Jensen MC, Wang JJ. (2008). “Adoptive immunotherapy for indolent non-Hodgkin lymphoma and mantle cell lymphoma using genetically modified autologous CD20- specific T cells. Blood, 112(6):2261–71.

13. Salter AI, Ivey RG, Kennedy JJ. (2018). “Phosphoproteomic analysis of chimeric antigen receptor signaling reveals kinetic and quantitative differences that affect cell function.” Sci Signal,11(544). doi: 10.1126/scisignal.aat6753.

14.Till BG, Jensen, M.C, Wang, JJ. (2012). “CD20-specific adoptive immunotherapy for lymphoma using a chimeric antigen receptor with both CD28 and 4-1BB domains: pilot clinical trial results. Blood ,119(17):3940–50.

15. Ramello, M.C., Benzaid, I., Kuenzi, B.M. (2019). “An immunoproteomic approach to characterize the CAR interactome and signalosome.” Sci Signal, 12(568). doi: 10.1126/scisignal.aap9777.

16. Chmielewski, M., Abken, H. (2015). “TRUCKs: the fourth generation of CARs.” Expert Opin Biol Ther, 15(8):1145–54.

17. Moon, E.K., Carpenito, C., Sun, J. (2011). “Expression of a functional CCR2 receptor enhances tumor localization and tumor eradication by retargeted human T cells expressing a mesothelin-specific chimeric antibody receptor.” Clin Cancer Res, 17(14):4719–30.

18. Guedan, S., Calderon, H., Posey, AD. (2019). “Engineering and design of chimeric antigen receptors.” Mol Therapy-Methods Clin Dev. 12:145–56.

19. Urnov, FD., Rebar, EJ., Holmes, MC. (2010). “Genome editing with engineered zinc finger nucleases.” Nat Rev Genet., 11(9):636–46.

20. Sander, JD., Joung, JK. (2014). “CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.” Nat Biotechnol. 32(4):347–55.

21. Miller, J.C., Tan, S., Qiao, G. (2011). “A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.” Nat Biotechnol, 29(2):143–8.

22. Carroll, D. (2008). “Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents.” Gene Therapy, 15(22):1463–8.

23. Moscou, M.J., Bogdanove, AJA. (2009). “Simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.” Science. 326(5959):1501–1.

24. Cong, L., Ran, F.A., Cox, D. (2013). “Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. “ Science, 339(6121): 819–23.

25. Haurwitz, R.E., Jinek, M., Wiedenheft, B. (2010). “Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease.” Science., 329(5997):1355–8.

26. Mali, P., Yang, L.H., Esvelt, K.M. (2013). “RNA-guided human genome engineering via Cas9.” Science, 339(6121):823–6.