Crispr
Güncelleme tarihi: 30 Tem 2020
Yaşar Yurtsever – İstanbul Teknik Üniversitesi, MBG
Düzenli aralıklarla bölünmüş palindromik tekrar kümeleri (CRISPR), günümüzde gen aktifleştirme, inaktif etme veya gen değiştirmek için kullanılan ve üzerinde yaygınca çalışılmakta olan bir yöntemdir. Sürekli etik tartışmalara sebep olan ve birçoğumuzun bildiği Çin’deki ikiz bebek vakasının[2] gösterdiği gibi insanlar üzerinde kullanılması hakkında katı kurallara sahip olan bir yöntemdir. Doğru kullanım ile çok başarılı bir yöntem olmasına rağmen bazı sınırlayıcı özellikleri sebebiyle zaman zaman istenmeyen sonuçlara sebep olması ve bazı genetik hastalıklar için -özellikle FA gibi uzun GAA dizilerinin olması- kullanımında bazı sıkıntıların olması sebebiyle üzerinde hala çalışılması gereken bir konudur. Genellikle kısa dizileri veya nokta mutasyonlarını düzeltmek için kullanılmaktadır.
Palindromik tekrarlar baştan ve sondan da yazılsa aynı şeyi ifade eden dizilerdir. Örneğin, ATGGTA gibi bir dizi baştan da sondan da okunsa aynı şeyi ifade eder. Bu tekrarlanan yapılar yük farklarından dolayı “stem loop” adı verilen tRNA’ya benzer şekiller oluşmasına sebep olur. Ek olarak “Protospacer adjacent motif” (PAM) adı verilen genellikle 3-6 bazlık diziler içeren sekanslar ile kullanılmaları gerekir. PAM sekansları çok fazla çeşide sahiptir ve hedeflenmesi gereken bölgelere göre seçilmelidir. Crispr sistemi 2 sınıftan oluşur ve tip I, tip II ve tip III[1] gibi birçok farklı crispr türü vardır ve kendi içlerinde çeşitli parçalara ayrılırlar. En çok bilinen türü tip II Cas9 proteini ile yapılan gen tedavileridir.
CRISPR, bakterilerin virüslere karşı gerçekleştirdiği bir savunma sistemidir. Doğada bakteriyofajların (bakterileri kullanan virüsler) istilalarına karşı bakteriler bu tarz savunma sistemlerine ihtiyaç duymuştur. Geliştirdikleri bu savunma sistemi ile temel olarak virüsün enfekte ettiği genomunu (spacer) alıp zararsız bir tekrar dizileri oluşturarak inaktive eder ve virüsün kendi genomunu entegre etmesini ve çoğalmasını engeller.[4] Bu tür bakteri kökenli savunma sistemleri ilk olarak 20. yüzyılın sonlarına doğru keşfedilmiştir. Ancak bu sistemin canlılar üzerinde nasıl kullanılabileceğini asıl ortaya çıkaran kişiler Berkeley’de Kaliforniya Üniversitesinde çalışan bilim insanı Jennifer Doudna ve Berlin’deki Max Planck Enstitüsü’nde çalışan Emmanuel Charpentier ile birlikte 2013 yılında yayınladıkları sonuçlar ve açıklamaları sayesinde bu sistemin nasıl çalıştığını anlayabilmek adına önemli adımlar atılmış oldu.[5]
Ancak crispr sistemi tek bir parçadan oluşmaz. Yönlendirilebilmesi için rehber RNA adı verilen gRNA’lar vardır. Kullanılan crispr tipine göre bu rehber RNA’lar da şekillenir.[3] Örneğin, Cas9 ile yapılan gen tedavi yöntemlerinde rehber RNA iki parçadan oluşan kompleks bir yapı şeklinde olur. Bu kompleksi oluşturan iki parçadan biri crRNA adı verilen crispr RNA ve trans aktif RNA (tracrRNA). Bu iki yapı gönderilen genom sekansının istenilen yere ulaşabilmesini sağlar. Diğer bir örnek, tip 5 sınıf 2 crispr türü olan Cpf1 proteini ile oluşan crispr yöntemi sadece bir adet crRNA’ya ihtiyaç duyar. Bu fark kullanmak istediğiniz sistemi etkiler çünkü cpf1 ile yaptığınız gRNA yaklaşık 40-45 nükleotit içerirken bu durum Cas9’da 100 nükleotidi bulmaktadır.
Şekil 1. Crispr Cas9 yapısının gösterimidir. Crispr sistemi tek başına genomu kesmek için Kullanılmaktadır ve sadece kesim işlemini gerçekleştirir. Ancak kesildikten sonra Düzenleme yapabilmek için bir donör DNA yardımıyla o bölgenin düzeltilmesi gerekir.[9]
Crispr sisteminin kısa olmasının birçok avantajı vardır. Örneğin, crispr sistemini istenilen konuma en yakın noktaya götürmek için genellikle kimyasal, fiziksel ve virüs kapsidleri gibi (dış zarları) iletim yöntemleri kullanılır. Özellikle adeno ilişkili virüslerin (AAV) sahip olduğu alt türler çok çeşitlidir ve genellikle dokuya özeldir. Örneğin AAV-8 serotipi karaciğere özeldir reseptörler içerir ve en verimli hareket ettiği organ karaciğerdir.[6] AAV’ler DNA virüsleridir ancak kısa genomları (4.7 kilobaz) olması sebebiyle her crispr tekniğiyle kullanılamamaktadır. Bunun yanında lentivirüsler gibi retrovirüsler Cas9 için özellikle daha yaygın kullanılmaktadır.[7]
Crispr tekniğinin bu zamana kadar elde ettiği birçok başarının yanında bazı temel sıkıntıları da vardır. Örneğin hedefini kaçırması (off-target) sonucu istenmeyen bölgelerde gen değişikliklerine sebep olabilmektedir. Fakat, bu gen değişikliklerinin nerde olabileceği hakkında bazı veri tabanları kullanılarak tahminler yapılabilir. Hedeflenmek istenen bölge için tasarlanan gRNA kompleksi de bunlar referans alınarak tasarlanır ve uygun kesici (restriksiyon) ve yapıştırıcı (ligaz) enzimlerinin düzeltilmek istenen yerler için seçilmesi gerekir. Eğer amacımız o geni inaktive etmek yani susturmak veya kapatmak ise o zaman donör DNA adı verilen kesilen bölgenin düzeltilmesi için belirlenen şablon görevi gören kısa oligo diziler ile tamamlanması için gönderilir.[8]
Günümüzde Crispr türevlerinin farklı kullanım alanlar vardır. Yapılan çalışmalarda ciddi bir artış ve başarılar vardır. Bu alanda en çok başarı alan hastalıklardan biri olan Nadir Hastalık sınıfında yer alan Duchenne Musküler Distropi’dir.[10] Bunun haricinde çeşitli kanser tiplerinde ve farklı genetik kökenli problemlerde denenmiş ve bu konularda çok büyük bir potansiyele sahip bir yöntemdir. Ancak var olan etik tartışmaların da önemsenmesi hem bu çalışmaların kötü amaçlara hizmet etmemesi hem de bilim kurgu yazarlarının değindiği süper insanlar gibi garip denemelerin de önüne geçilmesi açısından önem arz etmektedir. Her insan hayatı önemlidir ve crispr bu konuda çağ atlatacak öneme sahiptir, ama amacı dışında kullanımların potansiyel tehditleri de ciddiye alınması gerekir.
Referanslar
[1]: Liu, T., Pan, S., Li, Y., Peng, N., & She, Q. (2018). Type III CRISPR-Cas System: Introduction and its application for genetic manipulations. Current Issues in Molecular Biology, 1-14. doi: 10.21775/cimb.026.001
[2]: CRISPR Bebeklerin Haberi, Sandığınızdan Daha Korkunç Olabilir - Popular Science. (2020). 23 Haziran 2020 tarihinde alınmıştır, https://popsci.com.tr/crispr-bebeklerin-haberi- sandiginizdan-daha-korkunc-olabilir/
[3]: Ledford, H. (2015). CRISPR, the disruptor. Nature, 522(7554), 20-24. doi: 10.1038/522020a
[4]: Jiang, W., Maniv, I., Arain, F., Wang, Y., Levin, B., & Marraffini, L. (2013). Dealing with the Evolutionary Downside of CRISPR Immunity: Bacteria and Beneficial Plasmids. Plos Genetics, 9(9), e1003844. doi: 10.1371/journal.pgen.1003844
[5]: Sharon Begley, S. (2020). Three CRISPR Scientists Win Prestigious Award, Fanning Controversy Over Credit. Retrieved 23 June 2020, from https://www.scientificamerican.com/article/three-crispr-scientists-win-prestigious-award- fanning-controversy-over-credit/
[6]: Klein, R., Dayton, R., Tatom, J., Henderson, K., & Henning, P. (2008). AAV8, 9, Rh10, Rh43 Vector Gene Transfer in the Rat Brain: Effects of Serotype, Promoter and Purification Method. Molecular Therapy, 16(1), 89-96. doi: 10.1038/sj.mt.6300331
[7]: Kabadi, A., Ousterout, D., Hilton, I., & Gersbach, C. (2014). Multiplex CRISPR/Cas9- based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research, 42(19), e147-e147. doi: 10.1093/nar/gku749
[8]: Richardson, C., Ray, G., DeWitt, M. et al. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.Nat Biotechnol 34, 339–344 (2016). https://doi.org/10.1038/nbt.3481
[9]: Redirect Notice. (2020). Retrieved 23 June 2020, from https://www.google.com/url?sa=i&url=https%3A%2F%2Fwww.researchgate.net%2Ffigure% 2FCRISPR-Cas9-mediated-gene-editing-mechanisms-A-single-guide-RNA-sgRNA-recognizes- a_fig1_322251194&psig=AOvVaw1YEifZgACU4ZJm6xb351Sv&ust=1592993819759000& source=images&cd=vfe&ved=2ahUKEwj466jH2pfqAhXQ0uAKHQRCCXkQjRx6BAgAEA c
[10]: Ousterout, D., Kabadi, A., Thakore, P. et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun 6, 6244 (2015). https://doi.org/10.1038/ncomms7244