CRISPR/Cas9 Mekanizması ve Genom Düzenleme Etkinliği


Şeyma BULUT – Biyoteknoloji Yüksek Lisans, Bezmialem Vakıf Üniversitesi

CRISPR/Cas9 Nedir?

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, Düzenli Aralıklarla Bölünmüş Palindromik Tekrar Kümeleri) fonksiyonları ve CRISPR ile ilişkili genler (CRISPR-associated, Cas) belirli bakteri ve arkelerde edinilmiş bağışıklık için gereklidir, organizmaların istilacı genetik materyale karşı yanıt vermesini ve ortadan kaldırılmasını sağlamaktadır [1]. Bu tekrarlar ilk olarak 1980’lerde E.coli’de tanımlandı [2], ancak işlevlerinin tanımlanması 2017 yılında Barrangou ve ark. tarafından bulaşıcı bir virüsün genom fragmanının CRISPR bölgesine entegre edilerek S. thermophilus’un bir bakteriyofaja karşı direnç kazanabileceğini göstermesi ile aydınlatıldı [3].


CRISPR mekanizması ile ilgili farklı metotlar tanımlanmış olmakla birlikte en çok çalışılan mekanizmanın tip II olduğu bilinmektedir. Bu yöntemde; virüs veya plazmitlere ait olan DNA’nın hedeflenmesi için küçük parçalar şeklinde kesilir ve belli bir dizi kısa tekrarlar (yaklaşık 20 bç) CRISPR lokusuna dahil edilir. Lokuslar kopyalanır ve transkriptler; sekans tamamlanmasına bağlı olarak istilacı DNA’yı hedefleyen efektör nükleazlarını yönlendirmek için kullanılacak olan küçük RNA’ların (crRNA-CRISPR RNA) üretilmesi için işlenir (Şekil 1) [4].

Şekil 1: Edinme aşamasında yabancı DNA, bakteri genomundaki CRISPR lokusuna dahil edilir. CRISPR lokusları daha sonra kopyalanır ve crRNA biyogenezi sırasında crRNA’ya işlenir. İnterferans aşamasında bir crRNA ve ayrı tracrRNA ile kompleks halde bulunan Cas9 endonükleaz, PAM sekansına bitişik bir 20-nükleotid crRNA tamamlayıcı sekans içeren yabancı DNA’nın ayrılmasını sağlar [1].

Csn1 olarak da bilinen bir Cas proteini Cas9,’un knockdown deneyeleri sayesinde CRISPR metodu ve özellikle tip II CRISPR mekanizması için önemli bir faktör olduğu bildirilmiştir. Tip II CRISPR mekanizması, gen susturulması için sadece bir Cas proteini (Cas9) gerektirdiğinden dolayı diğer CRISPR mekanizmalarına kıyasla farklılık göstermektedir [5]. Tip II sistemlerinde Cas9, crRNA’ların işlenmesine katılır [5] ve hedef DNA’nın yok edilmesinden sorumludur [4]. Cas9’un bu iki adımdaki işlevi, iki nükleaz alanının amino terminal bölgesinde yer alan RuvC benzeri bir nükleaz alanı ve proteinin orta bölgesinde bulunan HNH benzeri bir nükleaz alanı varlığına dayanmaktadır [6].


Bölgeye özgü DNA tanınması ve bölünmesi elde etmek için Cas9, hem crRNA hem de kısmen crRNA’yı tamamlayıcı olan ayrı bir transaktivasyon crRNA (tracrRNA veya trRNA) ile kompleks halde bulunmalıdır [4]. TracrRNA, birden fazla crRNA’yı kodlayan transkripsiyon sonrasında crRNA’nın maturasyonu için gereklidir. Bu sistem, RNAaz III ve Cas9’un varlığında meydana gelmektedir [5].


Hedef DNA’nın yıkımı sırasında, HNH ve RuvC benzeri nükleaz alanları her iki DNA ipliğini de keserek ilişkili bir crRNA transkripti içinde 20-nükleotit hedef sekansı ile tanımlanan alanlarda çift zincirli kırıklar oluşturur [4, 7]. HNH alanı tamamlayıcı zinciri ayırırken RuvC alanı tamamlayıcı olmayan zinciri ayırır.


Cas9’un çift sarmallı endonükleaz aktivitesi aynı zamanda protospacer ile ilişkili motif (Protospacer-associated motif, PAM) olarak bilinen kısa korunmuş bir dizinin (2-5 nükleotit) crRNA tamamlayıcı dizisinin 3’ takip etmesini gerektirir [8]. Aslında tamamlayıcı diziler bile bir PAM dizisinin yokluğunda Cas9-RNA tarafından göz ardı edilir [9].


Moleküler Biyoloji Alanında Yeni Bir Yöntem Olarak Cas9 ve CRISPR Uygulamaları


Sadece üç gerekli bileşenle (crRNA, trRNA ile birlikte Cas9) tip II CRISPR nükleazının basit mekanizması bu sitemi genom düzenleme çalışmaları için uygun hale getirmektedir. Bu yaklaşım 2012 yılında Doudna ve Charpentier ekibi tarafından gerçekleştirilmiştir [4]. Daha önce tanımlanan tip II CRISPR mekanizmasına dayanarak araştırmacılar, trRNA ve crRNA’yı tek kılavuz RNA (single guide RNA, sgRNA) için birleştirerek basitleştirilmiş iki bileşenli bir sistem geliştirdiler. sgRNA ile programlanmış Cas9’un hedeflenen gen değişikliklerini yönlendirmede trRNA ve crRNA ile programlanan Cas9 kadar etkili olduğu gösterilmiştir (Şekil 2A).


Günümüze kadar, gen düzenlenme mekanizmaları için Cas9 nükleazının üç farklı çeşidi tanımlanmıştır. Birincisi, çift sarmallı DNA onarım mekanizmalarının aktivasyonu ile sonuçlanan, çift sarmallı DNA’yı bölgeye spesifik olarak kesebilen wild-type Cas9’dur. Çift zincir kırıkları homolog olmayan uçların birleştirilmesi ile onarılmaya çalışılarak hedef lokusa ait olmayan eklemeler veya delesyonlar ile sonuçlanabilir [10]. Alternatif olarak, hedef lokusa homoloji sağlayan bir sekans sağlanırsa; çift zincir kırıkları tarafından oluşan mutasyonların değiştirilmesine izin veren homoloji odaklı bir onarım yolu ile onarılabilir (Şekil 2A) [10, 11].


Cong ve ark. [12], Cas9 sistemini sadece nikaz aktivitesiyle Cas9D10A olarak bilinen mutant bir form elde ederek geliştirilmesine katkıda bulundular. Bu yalnızca bir DNA zincirinin ayrıldığı ve homolog olmayan uç birleştirme mekanizmasını etkinleştirilmediği anlamına gelmektedir. Bunun yerine, homolog bir onarım sekansı sağlandığında DNA onarımları sadece yüksek doğruluktaki homolojiye yönelik onarım yolu aracılığıyla gerçekleştirili, bu da delesyonlardan kaynaklanan mutasyonların azalmasını sağlamaktadır [4, 12, 13]. Cas9D10A, hedef spesifikliği açısından daha elverişli DNA kesikleri oluşturmak için tasarlanmış Cas9 kompleksleri tarafından hedeflenir (Şekil 2B) [14].


Üçüncü varyant nükleaz bulundurmayan bir Cas9’dur (nüclease-deficient, dCas9, Şekil 2C) [15]. HNH alanındaki H840A ve RuvC alanındaki D10A mutasyonları, DNA ayrılmasını inaktive eder ancak DNA bağlanmasını engellemez [4, 16]. Bu nedenle, bu varyant ayrılma olmaksızın genomun herhangi bir bölgesini sekansa spesifik olarak hedeflendirilmesi için kullanılabilir. Bunun yerine çeşitli efektör alanları ile bir araya gelerek dCas9, gen susturma veya aktivasyon amacı ile kullanılabilir [15, 17-20]. Ayrıca, görselleştime aracı olarak da kullanılabilir. Örneğin, Chen ve ark., tekrarlanan DNA dizilerini görselleştirmek için geliştirilmiş yeşil floresan proteine (Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP) ile dCas9 kullandığını bildirdi [21].

Şekil 2: CRISPR/Cas9 Mekanizması [1]

A. Wild-tip Cas9 nükleaz bölgesi, özellikle çift sarmallı DNA kırıkları homolog bir onarım sekans yokluğunda, homolog olmayan rekombinasyon delesyonların hedef sekansı bozmasına neden olabilir. Alternatif olarak, homolog onarım rekombinasyon sekans sağlanarak ve homolojiye yönelik onarım yolundan faydalanırak mutasyon ve onarımı yapılabilir.


B. Mutasyona uğramış Cas9, bölgeye özgü tek iplikli bir kesim yapar. İki sgRNA, daha sonra homolojiye yönelik onarım yapabilen kademeli olarak çift sarmallı kırıklar sağlamak için kullanılabilir.


C. Nükleaz bakımından eksik olan Cas9, spesifik lokalizasyona izin veren çeşitli efektör domainler ile birleştirilebilir. Örnek olarak; transkripsiyon aktivatörleri, baskılayıcılar ve floresan proteinleri.


Hedef Verimliliği ve Hedef Dışı Mutasyonlar


Hedef verimliliği veya istenen mutasyon yüzdesi, genom düzenleme mekanizmasının değerlendirilmesi için en önemli parametrelerden biridir. Cas9’un hedef verimliliği, TALEN’ler veya ZFN’ler gibi daha çok bilinen yöntemlerle olumlu bir şekilde karşılaştırılmaktadır [22]. Örneğin, insan hücrelerinde özel olarak tasarlanan ZFN’ler ve TALEN’ler yalnızca %1 ile %50 arasında değişen verim elde edebilir [22-24]. Buna karşılık, Cas9 mekanizmasının zebra balığı [25] ve bitkilerde [26] >%70’e varan; indüklenmiş pluripotent kök hücrelerde [27] %2-5 arasında verimlilik elde edildiği bildirilmiştir. Ek olarak, Zhou ve ark., tek hücreli fare embriyolarında %78’e kadar genom hedeflenmesinin geliştirildiği ve aynı zamanda tek bir geni hedeflemek için çift sgRNA kullanarak germ hattında başarılı olduklarını bildirdiler [28].


Mutasyonları tanımlamak için yaygın olarak kullanılan bir diğer yöntem T7 Endonükleaz I mutasyon tespit edilir (Şekil 3)[29, 30]. Bu test, istenen mutasyonlar dahil olmak üzere bir DNA dizisinin wild-type DNA dizisi ile tespit edilmesinden kaynaklanan heterodupleks DNA’yı saptamaktadır [30].


Şekil 3: T7 Endonükleaz I Hedef Verimliliği [1]

Genomik DNA, modifiye edilmiş lokusu tutan primerler ile amplifiye edilir. PCR ürünleri daha sonra denatüre edilir ve 3 olası yapı elde edilerek yeniden tutulur. Yanlış eşleşme içeren dupleksler T7 Endonükleaz I ile lizise uğratılır. Daha sonra DNA elektroforetik olarak ayrışıf ve hedef verimliliğinin hesaplanması için fragman analizi kullanılır.


Bir diğer önemli parametre, hedef dışı mutasyonların görülme sıklığıdır. Bu mutasyonların, bir PAM sekansına bitişik olduğu sürece, orijinal sekansa kıyasla sadece birkaç nükleotitin farklılığına sahip bölgelerde ortaya çıkması muhtemeldir. Bu durum, Cas9’un protospacer bölgesi [29] içinde en fazla 5 baz uyumsuzuğluna veya PAM sekansındaki [31] tek bir baz farkına tolerans gösterebilmesi bedeniyle oluşmaktadır. Hedef dışı mutasyonların saptanması genellikle daha zordur ve tüm genom sekanslarının ortadan kaldırılmasını gerektirmektedir.


Genom Düzenlenmesi ve Hedef Uygulamaları


2012 yılındaki tanımlamanın ardından [2], CRISPR/Cas9 mekanizması yaygın olarak benimsenmeye başlamıştır. Bu, insan [27], bakteri [32], zebra balığı [25], C. elegans [33], bitkiler [27], Xenopus tropicalis [34], maya [35], Drosophila [36], maymun [37], tavşan [38], domuz [33], sıçan [39] ve fare [34] dahil olmak üzere birçok hücre hattında ve organizmada önemli genlerin hedeflendirilmesi için başarıyla kullanılmıştır. Birçok grupta gRNA yoluyla belirli bir hedef gende tek nokta mutasyonları (delesyon veya insersiyon) oluşturmak için bu yöntemden faydalanılmıştır [7, 15, 23]. Aynı zamanda gRNA-Cas9 nükleaz kullanılarak büyük delesyon, insersiyon veya translokasyonlar gibi genomik düzenlemeleri elde etmek de mümkündür [40]. Son zamanlardaki bir diğer önemli gelişme ise, transkripsiyonel düzenleme [20, 41, 42], epigenetik modifikasyon [19] ve spesifik genom lokuslarının mikroskobik görüntülenmesi [21] için CRISPR/Cas9 mekanizmasının dCas9 tipinin kullanılmasıdır.


CRISPR/Cas9 mekanizması, hedef özgüllüğünün değiştirilmesi için crRNA’ların yeniden tasarlanmasını gerektirir. Bu, protein-DNA komplekslerinin yeniden tasarlanmasının gerekli olduğu ZFN ve TALEN’ler de dahil olmak üzere diğer genom düzenleme mekanizmalarından farklıdır. Ayrıca CRISPR/Cas9, gRNA kütüphaneleri [41, 43] oluşturarak genomik tarama için daha hızlı sonuç elde edilmesini sağlar.


Sonuç


Cas9’un hücre ve moleküler biyoloji araştırması için bir dizi yöntemler haline getirilmesindeki hızlı gelişmeler, sitemin basitliği, yüksek verimliliği ve çok yönlülüğü nedeniyle artış göstermektedir. Günümüzde genom mühendisliği için mevcut olan nükleaz mekanizmalarından CRISPR/Cas mekanizması diğer yöntemlere göre oldukça basit adımlar içermektedir.






Kaynakçalar

1. Reis, A., et al., CRISPR/Cas9 and targeted genome editing: a new era in molecular biology. NEB expressions, 2014. 1: p. 3-6.

2. Ishino, Y., et al., Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of bacteriology, 1987. 169(12): p. 5429-5433.

3. Barrangou, R., et al., CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science, 2007. 315(5819): p. 1709-1712.

4. Jinek, M., et al., A programmable dual-RNA–guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. science, 2012. 337(6096): p. 816-821.

5. Deltcheva, E., et al., CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature, 2011. 471(7340): p. 602-607.

6. Sapranauskas, R., et al., The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic acids research, 2011. 39(21): p. 9275-9282.

7. Kimura, P., et al., Molecular mechanism of CRISPR. Foundations of Crystallography, 2014. 156: p. 935-949.

8. Richter, C., et al., In vivo protein interactions and complex formation in the Pectobacterium atrosepticum subtype IF CRISPR/Cas System. PloS one, 2012. 7(12).

9. Sternberg, S.H., et al., DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature, 2014. 507(7490): p. 62-67.

10. Overballe-Petersen, S., et al., Bacterial natural transformation by highly fragmented and damaged DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2013. 110(49): p. 19860-19865.

11. Gong, C., et al., Mechanism of nonhomologous end-joining in mycobacteria: a low-fidelity repair system driven by Ku, ligase D and ligase C. Nature structural & molecular biology, 2005. 12(4): p. 304-312.

12. Cong, L., et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 2013. 339(6121): p. 819-823.

13. Davis, L. and N. Maizels, Homology-directed repair of DNA nicks via pathways distinct from canonical double-strand break repair. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2014. 111(10): p. E924-E932.

14. Ran, F.A., et al., Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell, 2013. 154(6): p. 1380-1389.

15. Qi, L.S., et al., Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell, 2013. 152(5): p. 1173-1183.

16. Gasiunas, G., et al., Cas9–crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2012. 109(39): p. E2579-E2586.

17. Kiani, S., et al., Cas9 gRNA engineering for genome editing, activation and repression. Nature methods, 2015. 12(11): p. 1051-1054.

18. Gilbert, L.A., et al., CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell, 2013. 154(2): p. 442-451.

19. Hu, J., et al., Direct activation of human and mouse Oct4 genes using engineered TALE and Cas9 transcription factors. Nucleic acids research, 2014. 42(7): p. 4375-4390.

20. Perez-Pinera, P., et al., Synergistic and tunable human gene activation by combinations of synthetic transcription factors. Nature methods, 2013. 10(3): p. 239.

21. Chen, B., et al., Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell, 2013. 155(7): p. 1479-1491.

22. Mussolino, C., et al., A novel TALE nuclease scaffold enables high genome editing activity in combination with low toxicity. Nucleic acids research, 2011. 39(21): p. 9283-9293.

23. Miller, J.C., et al., A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nature biotechnology, 2011. 29(2): p. 143.

24. Maeder, M.L., et al., Rapid “open-source” engineering of customized zinc-finger nucleases for highly efficient gene modification. Molecular cell, 2008. 31(2): p. 294-301.

25. Ni, W., et al., Efficient gene knockout in goats using CRISPR/Cas9 system. PloS one, 2014. 9(9).

26. Feng, Z., et al., Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell research, 2013. 23(10): p. 1229-1232.

27. Mali, P., et al., RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science, 2013. 339(6121): p. 823-826.

28. Zhou, J., et al., Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9‐mediated mouse genome targeting. The FEBS journal, 2014. 281(7): p. 1717-1725.

29. Fu, Y., et al., High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature biotechnology, 2013. 31(9): p. 822-826.

30. Mali, P., K.M. Esvelt, and G.M. Church, Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature methods, 2013. 10(10): p. 957-963.

31. Hsu, P.D., et al., DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology, 2013. 31(9): p. 827.

32. Pyne, M.E., et al., Coupling the CRISPR/Cas9 system with lambda red recombineering enables simplified chromosomal gene replacement in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol., 2015. 81(15): p. 5103-5114.

33. Oh, J.-H. and J.-P. van Pijkeren, CRISPR–Cas9-assisted recombineering in Lactobacillus reuteri. Nucleic acids research, 2014. 42(17): p. e131-e131.

34. Jiang, W., et al., RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology, 2013. 31(3): p. 233.

35. Hai, T., et al., One-step generation of knockout pigs by zygote injection of CRISPR/Cas system. Cell research, 2014. 24(3): p. 372-375.

36. Guo, X., et al., Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development, 2014. 141(3): p. 707-714.

37. DiCarlo, J.E., et al., Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research, 2013. 41(7): p. 4336-4343.

38. Gratz, S.J., et al., Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. Genetics, 2014. 196(4): p. 961-971.

39. Niu, Y., et al., Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell, 2014. 156(4): p. 836-843.

40. Ma, Y., et al., Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9. Cell research, 2014. 24(1): p. 122-125.

41. Mashiko, D., et al., Feasibility for a large scale mouse mutagenesis by injecting CRISPR/Cas plasmid into zygotes. Development, growth & differentiation, 2014. 56(1): p. 122-129.

42. Gratz, S.J., et al., CRISPR/Cas9-mediated genome engineering and the promise of designer flies on demand. Fly, 2013. 7(4): p. 249-255.

43. Mali, P., et al., CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature biotechnology, 2013. 31(9): p. 833.

0 görüntüleme

Türkiye'nin Tek Popüler Genetik Bilim Dergisi

Bezelye Dergi ISSN: 2587-0173

Bizi Takip Et
  • Beyaz Facebook Simge
  • Beyaz Instagram Simge
  • White Twitter Icon
  • Icon-gmail
  • kisspng-white-logo-brand-pattern-three-d
  • images
  • medium
  • Dergilik
  • YouTube

© 2019 by Bezelye Dergi