CRISPR/Cas9 Sisteminin LncRNA’ ların Fonksiyonun Anlaşılmasında Kullanımı
Güncelleme tarihi: 22 Nis 2019
İrfan Baki Kılıç- Acıbadem Mehmet Ali Aydınlar Üniversitesi, Moleküler ve Translasyonel Biyotıp Yüksek Lisans Öğrencisi
Geçtiğimiz son 10 yılda kanser ile ilişkilendirilen genlerin sayısı beklenmedik bir şekilde artmıştır. Teknolojik gelişmeler ile tümör dokusunun dizilenmesi genomun çeşitli bölgelerindeki mutasyon, epigenetik değişiklik ya da gen ekspresyonu değişimlerinin kansere sebep olduğu ortaya çıkmıştır. Bu değişimlerin uzun kodlanmayan RNA’lar (lncRNA) aracılığıyla tümör gelişimine sebep olabileceği de anlaşılmış ve kanser tedavisi için yeni birer hedef olarak belirlenmiştir.(1)
LncRNA’ ların moleküler mekanizmaları oldukça çeşitlilik gösterir fakat temel olarak 3 farklı şekilde etki ederler: moleküler etkileşimler, hücresel lokalizasyon ve başka bir gen üzerindeki düzenleyici etki.(2) LncRNA’lar etkileşimde oldukları diğer RNA’lara, genomik DNA bölgelerine veya proteinlere yapısal ve sekansa spesifik olarak bağlanırlar. Bu lncRNA ve hedef molekülü arasındaki etkileşim gen ekspresyonundan iyon kanalları aktivitesine kadar birçok hücresel işlemi etkiler. Protein kodlayan genlerin sayısını çoktan aşan lncRNA sayısı da 50bini (3) geride bırakmıştır. Yapılan transkriptom çalışmaları da bu sayıyı halen arttırmaktadır. Bu durumda lncRNA’ ların küçük bir kısmı bile fonksiyonel olsa kanser ve diğer hastalıkların tedavisi için kullanılabilecek binlerce potansiyel keşfedilmemiş gen bulunmaktadır. Bu yüzden lncRNA’ lar hala aydınlatılmayı bekleyen bir alan olarak güncelliğini korumaktadır.
Bu alan yeni ortaya çıkmaya başladığında lncRNA’ ların fonksiyonlarını ortadan kaldırarak (loss of function, LOF) görevleri anlaşılmaya çalışılıyordu ve bunun için RNAi’ ler kullanılıyordu. Fakat bu yöntem lncRNA’ lar için yeterli başarı oranını yakalayamadı ve aynı zamanda ekonomik olarak maliyeti fazlaydı. Son yıllarda genom mühendisliğindeki ilerlemeler ve CRISPR/Cas9 teknolojisi ile lncRNA’ lar dahil birçok genomik elementin kolay ve ucuz biçimde manipülasyonu mümkün oldu. Bu sayede kodlanmayan RNA’lara dair bilgimizde hızlı bir şekilde artmaya başladı.
CRISPR/Cas9 genom düzenleme teknolojisi Streptococcus pyogenes’ in immün sistemindeki bir adaptasyonun manipüle edilerek kullanılmasıyla ilişkilidir.(4) Bu sistem 2 parçadan oluşmaktadır. Bağlandığı DNA bölgesinde çift zincir DNA kırıkları oluşturan Cas9 endonükleaz enzimi ve enziminin hedef bölgeye bağlanmasını sağlayan bir rehber RNA molekülünden oluşur. Bilim insanları geliştirdikleri bu sistemle rehber RNA ile bir bölgeyi hedefleyerek o bölgede baz değişiklikleri yapabilmektedir. Ayrıca Cas9 enzimine bazı kargo proteinler eklenerek istenilen genomik bölgede bu proteinler ile farklı modifikasyonlar yapılabilmektedir.
CRISPR sistemi başlarda sadece protein kodlayan bölgeler için dizayn ediliyor bu durumda açık okuma çerçevesinde olmayan bölgelerde mutasyon yaratılamıyordu. Fakat zamanla bu sistem değiştirildi ve kodlanmayan bölgelerde uygulanabilir hale getirildi. Son gelişmeler sonucunda CRISPR/Cas9 sistemi yardımıyla lncRNA’lar kodlayan bölgelerde hedeflenebilmektedir. Hedeflenen lncRNA’lar da kalıcı olarak delesyon ya da geçici olarak transkripsiyon aktivasyon ve inhibisyon yapılabilmektedir.
LncRNA’ların fonksiyonun anlamak için en çok kullanılan LOF metodu genomdan bazı bölgeleri silmektir. CRISPR-del yöntemi ile de genomdan istenilen bölge silinebilmektedir. Bu yöntemde bir çift CRISPR/Cas9 kompleksi silinmek istenilen bölgenin iki ucu için dizayn edilir bu sayede hedef bölgenin iki ucunda çift zincir DNA kırıkları oluşturulur. DNA daha sonra homolog olmayan uç birleştirme (non-homologus end joining) ile düzeltilmeye çalışılır fakat bazı durumlarda bu düzeltme işlemi başarılı olmaz ve iki ucu kırılan hedef bölgesi genomdan silinir.(6) Bu yöntem lncRNA’ların delesyonu için kullanılır ve %10-40 oranında başarı sağlanabilir. Örneğin yapılan CRISPR-del yöntemi ile yapılan bir çalışmada LncRNA AK023948’in Akt yolağını pozitif olarak regüle ettiği ortaya çıkarılmıştır.
CRISPRi yöntemi ile de Cas9 enzimine bazı kargo proteinler bağlanarak hedef bölgenin transkripsiyonel olarak geçici baskılanması sağlanabilir. Bunun için Cas9’un inaktif bir formu olan dCas9 kullanılır. CRISPRi yöntemi bir genin transkripsiyonu 15 kata kadar azaltılabilir hem kodlayan hem de kodlanmayan bölgelere uygulanabilir.(7) Bu yöntem CRISPR-del’ in aksine tersine çevrilebilirdi yani geçici olarak transkripsiyon baskılanır.
CRISPRa yöntemi ise geçici olarak bir bölgeye transkripsiyonel aktivite sağlar. Temelinde CRISPRi yöntemine benzemektedir fakat dCas9’a bağlanan proteinler bu kez aktivasyona sebep olmaktadır. Bu durumda hedeflenen bölge fonksiyon kazanmaktadır (gain of function, GOF). Bu sayede istenilen bir bölge aşırı eksprese edilmek istendiğinde diğer yöntemlere göre daha kolay ve ucuz olmasının yanı sıra doğrudan hedef bölge hücrede bulunduğu doğal formunda endojen olarak eksprese edilecektir. (7)
Gün geçtikçe ve teknoloji ilerledikçe yeni proteinler, kodlanmayan RNA’lar gibi birçok genomik element keşfedilmekte ve keşfedilmeye devam etmektedir. Aramıza yeni katılan ve fonksiyonu henüz keşfedilememiş birçok lncRNA halen araştırılmayı beklemektedir. Bu araştırmalar için ucuz ve kolay olması nedeniyle günümüzde sıklıkla kullanılan CRISPR/Cas9 teknolojisi elbette çok önemli bir yer tutmaktadır. Avantajlarına rağmen bu sistemin bazı dezavantajları da vardır. Bunlardan en önemlisi rehber RNA’nın genomda istenilen bölgeden başka bölgeleri de hedeflemesidir. Bu istenmeyen hedefler (off-target) yapılan çalışmalarda zorluklara ve hatalara sebep olabilmektedir.(8) Bir diğer dezavantaj ise CRISPR sistemiyle aynı gendeki silinen bölgeye göre farklı etkiler çıkabilmektedir. Bu durumda bir aslında çok etkili bir lncRNA’nın fonksiyonel olmayan bir bölgesi silebilir ve bu lncRNA hakkında yanlış sonuçlar görülebilir. Dezavantajlarına rağmen avantajlarının çokluğu nedeniyle CRISPR sistemi gen düzenlemesi için ve lncRNA’ların fonksiyonun anlaşılması için kullanılmaya devam edilmektedir.
Resim 1:
A: Crispr/Cas9 sisteminin çalışma mekanizması gösterilmiştir. Cas9, rehber RNA yardımıyla bağlanır. Ardından Cas9 kendine özgü PAM (protospacer-associated motif) sekansından sonra DNA’da çift zincir kırık oluşturur. (Cas9 için PAM sekansı NGG)
B: CRİSPR-del sistemi ile gerçekleştirilen bir delesyon gösterilmiştir. Hedef bölgenin iki ucuna uygun rehber RNA dizayn edilir. Böylece hedef bölgenin 2 ucu Cas9 kesilir ve bölge silinir.
C: CRISPRi ve CRISPRa sistemleri gösterilmiştir. dCas9 enzimine farklı kargo proteinler eklenerek hedef bölgelerin geçici olarak transkripsiyonel baskılanması ya da aktivasyonu sağlanmıştır.
Kaynakça:
Lanzo´ s, A., Carlevaro-Fita, J., Mularoni, L., Reverter, F., Palumbo, E., Guigo´ , R., and Johnson, R. (2017). Discovery of cancer driver long noncoding RNAs across 1112 tumour genomes: new candidates and distinguishing features. Sci. Rep. 7, 41544.
Guttman, M., and Rinn, J.L. (2012). Modular regulatory principles of large noncoding RNAs. Nature 482, 339–346.
Uszczynska-Ratajczak, B., Lagarde, J., Frankish, A., Guigo´ , R., and Johnson, R. (2018). Towards a complete map of the human long non-coding RNA transcriptome. Nat. Rev. Genet. 19, 535–548.
Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P.D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L.A., et al. (2013). Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819–823.
Esposito et al., Hacking the Cancer Genome: Profiling Therapeutically Actionable Long Non-coding RNAs Using CRISPR-Cas9 Screening, Cancer Cell (2019)
Vidigal, J.A., and Ventura, A. (2015). Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nat. Commun. 6, 8083.
Gilbert, L.A., Larson, M.H., Morsut, L., Liu, Z., Brar, G.A., Torres, S.E., Stern-Ginossar, N., Brandman, O., Whitehead, E.H., Doudna, J.A., et al. (2013). CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell 154, 442–451.
Goyal, A., Myacheva, K., Groß, M., Klingenberg, M., Duran Arque´ , B., and Diederichs, S. (2017). Challenges of CRISPR/Cas9 applications for long noncoding RNA genes. Nucleic Acids Res. 45, e12.