DNA Hasarlarının Tespiti : Comet Assay
Esengül Öztürk - Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi
Organizmalara ait genomik bilgileri içeren çift sarmal yapıya sahip DNA çeşitli nedenlerden dolayı hasarlara maruz kalmaktadır. Bu hasarların tespit edilmesinde farklı yöntemler kullanılmaktadır. Bu yöntemlerden biri olan “Comet assay” ökaryotik hücrelerde DNA hasarını ölçmek için yaygın olarak kullanılan yöntemler arasında yer almaktadır. Bilimsel literatürde Comet assay “tek hücreli jel elektroforezi” ve “kuyruklu yıldız” olarak da adlandırılmaktadır.[1]
Comet tekniği ilk olarak 1984 yılında Östling ve Johanson tarafından geliştirilmiş, in vivo (canlı içinde) ve in vitro (canlı dışında) modellerde yaygın olarak kullanılmıştır.[1] Bu sayede, DNA hasar seviyelerinin erken teşhisi, hasarlı hücrelerin çevre genotoksik potansiyeli hakkında veriler elde etmekte ve olası hastalık tedavilerinde önemli adımlar atmaya imkan tanımaktadır. Temel prensibine bakıldığında ise, elektroforez sırasında hücre içerisindeki çekirdeklerden çıkan denatüre olmuş DNA parçalarının miktarının ölçümüne dayanmaktadır. Bu ölçüm sonrasında ise DNA fragmanlarına ait hasarın seviyesi belirlenmektedir.[2]
İnsan hücrelerindeki DNA hasar oranlarına bakıldığında günde yaklaşık 70.000 hasar oluşumuna rastlanmaktadır.[3] Bu hasarlar genellikle hücrelerdeki DNA replikasyonu sırasında meydana gelmektedir. Ortaya çıkan DNA hasarları endojen (metabolik) ve eksojen(çevresel) olmak üzere iki ana sınıftan oluşmaktadır. Endojen DNA hasarı, DNA zincirinin su ve reaktif oksijen türleri (ROS) ile hidrolitik ve oksidatif reaksiyon oluşturmasından kaynaklanmaktadır. Eksojen DNA hasarı ise çevresel, fiziksel ve iyonlaştırıcı radyasyon (IR), ultraviyole (UV), radyasyon gibi çeşitli kimyasalların DNA'ya hasar vermesi sonucu ortaya çıkmaktadır. Hücrelerde başlayan ve istenilen şekilde onarılmayan hasarlı DNA, organizmanın gelişimini ve yaşlanma sürecini değiştirebilecek genomik dengesizliğe, apoptoza veya yaşlanmaya yol açabilir. Hatta, hasarlı hücrelerin bölünmeye devam etmesi durumunda organizmalarda immün yetmezliğine, nörolojik bozukluklara ve kanser oluşumuna neden olmaktadır. Bu sebeple DNA hasarlarının belirlenmesinde çeşitli tespit yöntemleri kullanılmaktadır.[4,5]
Commet assay dışındaki tespit yöntemlerinin avantaj ve dezavantajları şu şekildedir:
Commet assay yönteminin avantajlarına bakıldığında ise;
-her tür hücredeki hasarların değerlendirilmesi
-yüksek hassasiyet
-analiz için gerekli az sayıda hücre
-incelemeler için hücre seçiminde esneklik
-düşük maliyet
-basitlik ve kısa analiz süresi
-güvenilir istatistiksel analiz
-farklı DNA hasarlarının değerlendirilmesi olasılığı
maddeleri sayılabilir.[2] Dolayısıyla, bu karşılaştırma Comet testinin düşük seviyelerde DNA hasarını tespit etmek için oldukça hassas bir yöntem olduğunu göstermektedir.[6]
Comet yöntemi daha detaylı incelendiğinde testin elektroforez basamağında, hasarlı DNA fragmanlarının floresan boyalar kullanılması ile kuyruklu yıldızın kuyruğunu andıran bir iz bırakarak elektriksel alanda hareket etmeleri esasına dayanır. Oluşan DNA hasarlarının görüntülenmesi ve hasarın seviyesinin tespiti ise floresan mikroskobu ile belirlenmektedir.[7]
Commet assay yöntemi, kullanılan hücre tipi ve DNA hasar çeşidine göre farklılık göstermektedir. Genel olarak bakıldığında ise bu yöntemin temel basamakları şu şekildedir:
1- Hücrelerin izolasyonu
2- Slaytların hazırlanması
3- Hücre lizizi
4- Tek hücreli elektroforez
5-Nötralizasyon
6-Boyama ve değerlendirme
Comet testinde öncelikle belirlenen organizmadan doku örneği alınarak hücrelerin izolasyonu ve süspansiyonu yapılır. Sonrasında hücreler agaroz jellere gömülerek slaytlar hazırlanır. Bir sonraki basamakta hücrelere ait membranları ve diğer hücresel materyalleri çıkarmak için hipertonik ve iyonik olmayan lizis çözeltileri ile muamele edilir. Böylece hücre içerisinde DNA dışındaki tüm yapılar denatüre olur. Testin dördüncü basamağında ise, elde edilen DNA fragmanları yüksek alkali çözeltisi içeren elektroforez işlemine tabi tutulur. Bu işlem sayesinde DNA parçaları agaroz jel tabakaları arasında çekirdekten uzaklaşarak kuyruklu yıldız görünümü elde edilmektedir. Nötralizasyon basamağında elektroforez işlemi sırasında kullanılan yüksek konsantrasyona sahip çözeltiler uzaklaştırılır. Son olarak, boyama ve değerlendirme basamağında EtBr, DOX, DMSO gibi floresan boyalarla boyama yapılarak floresan mikroskobunda görüntülemeler yapılır. Elde edilen verilerle kuyruk momenti hesaplanıp, kuyruk uzunluğuna bağlı olarak DNA hasarının seviyesi belirlenir.[7,8]
Comet assay yönteminin tıpta geniş uygulama alanları bulunmaktadır. Örneğin tümör hücrelerinde DNA hasarlarının ve DNA'ya zarar veren kimyasalların ve bunların çeşitli DNA onarım mekanizmalarının özelliklerinin değerlendirilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bunun yanı sıra, sperm DNA'sının kalitesi Comet assay testi ile değerlendirilmiş olup erkek infertilite bireylerde, fertil erkeklerinkine kıyasla sperm DNA hasarının artış gösterdiği belirlenmiştir. Son olarak da Diabetes mellitus, Romatoid artrit gibi kronik hastalıkların çoğunun ve ayrıca Alzheimer ve Parkinson gibi nörodejeneratif hastalıklardaki DNA hasarlarının tespiti de Comet assay yöntemiyle tespit edilmektedir.[6]
İnsan genomunda hem çevresel hem de genetiksel faktörlerle ortaya çıkan DNA hasarı gün geçtikçe artmaktadır. Bu artış, başta kanser olmak üzere birçok hastalığın erken teşhis ve tedavisini beraberinde getirmektedir. Bu nedenle, Comet assay DNA hasarlarının tespit edilmesinde başarılı bir yöntem olarak karşımıza çıkmaktadır. Ayrıca, bu testin basit ve hızlı bir uygulamaya sahip olması yöntemi daha kullanışlı hale getirmektedir. Dolayısıyla, DNA hasarını içeren diğer kronik hastalıkların da belirlenmesinde Comet assay potansiyel bir yöntem olarak kullanılabilir.[6]
Referanslar
1. Langie, Sabine A. S., Amaya Azqueta, and Andrew R. Collins. 2015. “The Comet Assay: Past, Present, and Future.” Frontiers in Genetics.
2. Widziewicz, Kamila, Joanna Kalka, Magdalena Skonieczna, and Pawe Madej. 2012. “The Comet Assay for the Evaluation of Genotoxic Potential of Landfill Leachate.” The Scientific World Journal. doi: 10.1100/2012/435239.
3. Tubbs, Anthony, and André Nussenzweig. 2017. “Endogenous DNA Damage as a Source of Genomic Instability in Cancer.” Cell.
4. Hakem, Razqallah. 2008. “DNA-Damage Repair; the Good, the Bad, and the Ugly.” EMBO Journal. doi: 10.1038/emboj.2008.15.
5. Chatterjee, Nimrat, and Graham C. Walker. 2017. “Mechanisms of DNA Damage, Repair, and Mutagenesis.” Environmental and Molecular Mutagenesis.
6. Vidya, G., V. Gladwin, and Parkash Chand. 2015. “A Comprehensive Review on Clinical Applications of Comet Assay.” Journal of Clinical and Diagnostic Research.
7. Lu, Yanxin, Yang Liu, and Chunzhang Yang. 2017. “Evaluating in Vitro DNA Damage Using Comet Assay.” Journal of Visualized Experiments. doi: 10.3791/56450.
8. Møller, Peter, Amaya Azqueta, Elisa Boutet-Robinet, Gudrun Koppen, Stefano Bonassi, Mirta Milić, Goran Gajski, Solange Costa, João Paulo Teixeira, Cristiana Costa Pereira, Maria Dusinska, Roger Godschalk, Gunnar Brunborg, Kristine B. Gutzkow, Lisa Giovannelli, Marcus S. Cooke, Elke Richling, Blanca Laffon, Vanessa Valdiglesias, Nursen Basaran, Cristian Del Bo’, Bojana Zegura, Matjaz Novak, Helga Stopper, Pavel Vodicka, Sona Vodenkova, Vanessa Moraes de Andrade, Monika Sramkova, Alena Gabelova, Andrew Collins, and Sabine A. S. Langie. 2020. “Minimum Information for Reporting on the Comet Assay (MIRCA): Recommendations for Describing Comet Assay Procedures and Results.” Nature Protocols.
9. Abcam. n.d. “Comet Assay Kit.” Retrieved (https://www.abcam.com/).