DNA-PAINT Tekniğiyle Sinaps Proteinlerini Görüntüleme
Cansu Erdem - Ege Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi
Beyinde yer alan milyonlarca nöron birbirleri ile daimi bir sinaptik iletişim içerisidedir. Sinapsların barındırdığı yüzlerce farklı tip protein, yapılan işlemi özelleştirir. Sinaptik proteinlerin görüntülenip incelenmesi, gen ifadesinin baskılanmasından kaynaklanan bilişsel hastalıkların (otizm, şizofreni gibi) nedenlerinin daha iyi aydınlatılması, tedavi edilmesi ve hatta önlenmesi açısından yarar sağlayabilir.
Sinaptik proteinlerin görevlerinden en önemli olanı nörotransmitter aktarımı sırasında nöronlar arasında bir çeşit köprü sağlamalarıdır. Çok sayıda sinaptik protein geni psikiyatrik ve nörolojik hastalıklarda rol oynamıştır ve sinaptik protein ifade seviyelerinin organizmalar, beyin bölgeleri ve nöronal hücre alt tipleri arasında geniş ölçüde değiştiği bilinmektedir. Sinaptik protein kompozisyonu, translasyonel sinirbilim için büyük öneme sahiptir. Floresans görüntüleme, sinaptik protein ifade seviyelerinde ve bozulmamış nöronal numuneler içindeki lokalizasyonlardaki heterojenliği karakterize etme fırsatı sunarken, geleneksel görüntüleme yaklaşımları kullanıldığında herhangi bir nöronal numunede en fazla 4 protein türü görselleştirilebilmektedir.
Bu sayıyı arttırmak ve çalışmayı pratik hâle getirebilmek için MIT ekibi DNA-PAINT adlı mevcut bir metoda dayanarak yeni bir teknik geliştirdi. Aslen Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nden Eric Betzig, Almanya’daki Max Planck Biyofiziksel Kimya Enstitüsü’nden Stefan Hell ve ABD’deki Stanford Üniversitesi’nde görev yapan WE Moerner'ın 2014 yılında Nobel Kimya Ödülü'nü kazanmalarını sağlayan "Süper Çözünürlüklü Floresans Mikroskopisi" isimli çalışmaya dayanan bu bilgi sayesinde, geliştirilmiş olunan optik görüntüleme ile süper çözünürlüklü görüntüler elde edilebiliyor. Geliştirilen işlemde, geleneksel tekniğin 3 kat daha verimli sürümü olarak binlerce sinaps içeren hücresel örnekten tek seferde 12 protein gözlenebiliyor. Aynı zamanda bu teknik, geleneksel floresans mikroskopisinin sorunlarından biri olan difraksiyon (saçılma) olayını da engelleyecek nitelikte. Difraksiyon sorunu kısaca, görüntülenecek materyalin dalga boyunun görünür ışığın dalga boyundan küçük ve/veya 200 nm civarlarında olması durumunda nesnenin görüntüsünün cihaz tarafından ayırt edilememesi durumuna dayanıyor.
DNA-PAINT (DNA Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography) (Nano Ölçekli Topografide Noktaların Birleştirilmesi) yönteminde, klasik difraksiyon sınırının altında kalan yapıların yüksek çözünürlükte görüntülenebilmesi sağlanıyor. DNA-PAINT yönteminde, bir DNA-antikor probu kullanılır. Bu prob, genelde oligonükleotit (az sayıda nüleotit içeren ssDNA(tek zincirli DNA) yapısı) ve bağlanılan yapıda bir belirteç oluşturacak olan florofor molekülünden oluşmaktadır. Florofor molekülünün hedef moleküldeki işlevi, o moleküle geçici olarak bağlandığında bir çeşit yanıp sönme (blinking traces) durumu meydana getirmesi sayesinde hedef molekülün cihazlar tarafından algılanabilmesini sağlamasıdır. Bu çalışmada hedef molekül sinaps proteinleri olduğundan, DNA-antikor probu proteinlere bağlanacaktır. Bağlanma, hedef moleküldeki bağlanma noktalarında (docking strands) gerçekleşir.
Araştırmacılar bu tekniği, iskele proteinleri, hücre iskeleti ile ilişkili proteinleri ve uyarıcı veya engelleyici sinapsları işaret ettiği bilinen proteinleri içeren sinapsta bulunan 12 farklı proteini etiketlemek için kullandılar. Baktıkları proteinlerden biri, hem otizme hem de şizofreniye bağlanmış bir iskele proteini olan shank3'tür. Binlerce nörondaki protein seviyeleri analiz edilerek, birbirleriyle daha sık bağlantı kurma eğiliminde olan protein gruplarını belirlenip, içerdikleri proteinlerde farklı sinapsların nasıl değiştiği anlaşıldı. Bu tür bir bilgi, sinapsların işlevlerini ortaya çıkarmaya yardımcı olabilecek alt türlere sınıflandırmasına yardımcı olmak için kullanılabilir.
MIT'deki araştırmacılar bu tekniği kullanarak elde ettikleri protein görüntülerini sınıflandırarak, başta otizm ve şizofreni olmak üzere çeşitli bozuklukların gen ifadesini değiştirmek suretiyle, sinapslardaki proteinlerin yapısını ve birbirleriyle olan ilişkilerini nasıl etkilediğini anlamayı amaçlıyorlar. Otizm ve şizofreni gibi rahatsızlıklara sahip olan insanların genomları sıralanarak, yüzlerce hastalıkla ilişkili genetik varyantlar tanımlandı. Ancak bu varyasyonların hastalıklar için nasıl bir etkisi olduğu, bilim insanlarınca araştırılmaya devam ediliyor.
Kaynakçalar
Technique Can Image Individual Proteins Within Synapses. Erişim Adresi: https://neurosciencenews.com/protein-image-synapse-14996/
Super-Resolution Microscopy: Adapting DNA-PAINT Technology to Confocal Microscopes. Erişim Adresi: https://www.imaging-git.com/news/super-resolution-microscopy-adapting-dna-paint-technology-confocal-microscopes
DNA-Based Super-Resolution Microscopy: DNA-PAINT. Erişim Adresi: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6315775/
Multiplexed and high-throughput neuronal fluorescence imaging with diffusible probes. Erişim Adresi: https://www.nature.com/articles/s41467-019-12372-6
Görsel.1 erişim adresi: https://vertassets.blob.core.windows.net/image/74ca975c/74ca975c-31b3-4eb0-86b8-5e82fe9ea865/image2.png
Görsel.2 erişim adresi: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click%20on%20image%20to%20zoom&p=PMC3&id=6315775_genes-09-00621-g004.jpg
Görsel.3 erişim adresi: https://i2.wp.com/neurosciencenews.com/files/2019/09/protein-synapse-imaging-neurosciencenews.jpg?ssl=1