Gen Klonlama ve pXST Vektörü


Başak Toker, Gebze Teknik Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik

Gen Klonlamasına Genel Bir Bakış


Moleküler biyoloji, genetik, biyoteknoloji gibi alanlarda bir geni çoğaltmak ve klonlamak büyük önem taşımaktadır. Klonlama, bir canlıdan alınan genetik materyalin kullanılması ile aynı canlıdan başka kopyalar oluşturulmasıdır. Gen klonlamasında, bir organizmadan DNA elde edildikten sonra bu DNA’da, enzimler yardımı ile nükleotidler arasındaki bağlardan kırılır. İstenilen parça kırıldıktan sonra başka bir plasmid DNA ile birleştirilir. Son olarak ise bu iki DNA’nın birleşiminden oluşan plasmid DNA, yaşayan bir bakteriye aktarılır. Klonlama çalışmaları için birçok metot geliştirilmiştir.


Genel olarak klonlama metotları ligaz kullanılıp kullanılmamasına göre ikiye ayrılır. Ligase Independent Cloning (ligaza bağlı olmayan klonlama – LIC) tekniğinde insertler genellikle PCR ile çoğaltılır. Vektörler ise restriksiyon endonükleazları yardımıyla lineer hale getirilir. Vektör ve insertin birleşmesi ise T4 DNA polimeraz’ın 3’→ 5’ exonükleaz aktivitesi kullanılarak yapılır. Bu teknik klonlama için ideal bir teknik olsa dahi bir hayli karmaşık bir protokole sahip olduğundan dolayı ligaz kullanılan yöntemler daha çok tercih edilmektedir.


Ligaz kullanılan yöntemlerden bazıları yapışkan uç, küt uç ve TA klonlamalırıdır. Yapışkan uç ligasyonu, hedef DNA dizilerini plazmide bağlar ve bu yöntem ile yüksek rekombinant verimi elde edilir. Fakat çok fazla klonlama bölgesi olan insertler için uygun restriksiyon enzimini seçmek bir hayli zordur. Küt uç klonlaması bu problemin önüne geçse de bu yöntemde DNA’nın kendi kendine bağlanma riski vardır. TA klonlamasına geldiğimizde ise bu yöntem Taq polimerazının özelliği sayesinde kendi kendine bağlanmaların önüne geçebilmektedir. Bu sebeple TA klonlaması en kolay ve en etkili yöntem kabul edilmektedir.

pXST Vektörü


2018 yılında BMC Biotechnology’de yayımlanan bir makaleye göre pXST; küt uç ve TA klonlamalarında kullanılabilecek, kolay bir mekanizması ve yüksek verimliliği olan bir vektördür.



Bu vektörü oluşturmak için pDONOR221 plasmidinin ccdB gen bölgesi ile pMD-19 T plasmidi birleştirilmiştir. Daha sonra elde edilen plasmid, E.coli DB3.1 ve DH5α kompetent hücrelerine transfer edilmiştir. E.coli DB3.1 ccdB genine dayanıklı, DH5α ise dayanıksızdır ve bu gen varlığında hücreler ölmektedir.


Bunun dışında ccdB’nin hangi yönde vektöre bağlandığının önemli olup olmadığını görmek adına ters ve düz bir şekilde entegre olmuş ccdB genine sahip olan hücrelerin aynı koşullarda büyüyüp büyümedikleri kontrol edilmiştir. Ters ccdB’ye sahip hücrelerin çoğaldığı görülmüştür. Bu da ccdB geminin ölümcül etkisinin ters oryantasyonda çalışmadığını göstermiştir.


Daha sonra TA klonlama ve küt uç klonlama tekniklerinden hangisinin daha etkili olduğunu ve insert boyutunun etkisini görmek için transformasyon verimleri hesaplanmıştır. Bunun sonucunda insert boyutu arttıkça verimin azaldığı ve TA klonlama metodunun daha etkili olduğu görülmüştür.


Figür 2. Farklı boyda insertler ile bakterilerin transformasyon verimleri

Peki pXST vektörünün avantajları nedir? Özellikle ccdB geminin hücreler için ölümcül olması, kendi kendine ligasyonun büyük oranda önüne geçmiştir. Zira vektör kesilen yerden kendi kendine birleştiği taktirde ccdB geni aktive olmaktadır ve istemediğimiz sonuca sahip olan hücreler ek bir prosedüre gerek kalmadan elenmektedir. Kendi kendine ligasyon olmadığı ve araya insert yerleştirildiği takdirde ise bu gen aktif olmayacak ve hücreler yaşayacaktır.


Ayrıca transformasyon verimliliği µg plasmid başına 3 x 106 ve 8.3 x 106 arasında bulunmuştur. Bu da gen klonlamasında kullanılmak için bir hayli uygun olduğunu göstermektedir. Bunun yanı sıra TA klonlaması için pUC18 bazlı bir vektör olan pELMO kıyaslanılabilir olduğu düşünülmüştür. Birçok klonlama bölgesi içerdiğinden dolayı ise, araştırmacıların istedikleri restriksiyon enzim bölgesini eklemelerine olanak sağlamaktadır.






Kaynakçalar

1. https://www.neb.com/applications/cloning-and-synthetic-biology/ligation-independent-cloning (13.03.2020)

2. Liu, Qin & Dang, Hui-Jie & Wu, Yuan-Hang & Li, Min & Chen, Yin-Hua & Niu, Xiao-Lei & Li, Kai-Mian & Luo, Li-Juan. (2018). pXST, a novel vector for TA cloning and blunt-end cloning. BMC Biotechnology. 18.

3. https://bmcbiotechnol.biomedcentral.com/track/pdf/10.1186/s12896-018-0456-8 (12.03.2020)

4. https://www.future-science.com/doi/pdf/10.2144/000113761 (12.03.2020)

5. https://blog.addgene.org/plasmids-101-colony-pcr (12.03.2020)

6. https://en.wikipedia.org/wiki/Gateway_Technology (12.03.2020)

7. https://www.livescience.com/58079-cloning-facts.html (15.03.2020)


0 görüntüleme

Türkiye'nin Tek Popüler Genetik Bilim Dergisi

Bezelye Dergi ISSN: 2587-0173

Bizi Takip Et
  • Beyaz Facebook Simge
  • Beyaz Instagram Simge
  • White Twitter Icon
  • Icon-gmail
  • kisspng-white-logo-brand-pattern-three-d
  • images
  • medium
  • Dergilik
  • YouTube

© 2019 by Bezelye Dergi