Gen Transformasyonunda Yeni Bir Metot: Yoshida Etkisi
Menşura Feray ÇOŞAR- Moleküler Biyoloji ve Genetik bölümü, Fen Edebiyat Fakültesi, İstanbul Teknik Üniversitesi
Moleküler biyolojide transformasyon, bir hücrenin içine dışarıdan bir DNA parçasının girmesi ve hücrenin genomu ile bütünleşmesi sonucu hücrede gerçekleşen genetik değişikliğe denir [1,2]. Hücre dışında bulunan serbest DNA parçaları ancak uygun haldeki bakteri, mantar, alg, maya ya da bitki hücrelerine girebilir. Pek çok çalışmanın amacında yer alan değişiklik ve gözlem, çalışılan organizmaya hedeflenen değişikliği sağlayacak olan DNA parçasının aktarılması ile mümkün olabilmektedir. DNA'yı bakterilere sokmanın etkili yollarını keşfetmek, genetik mühendisliği ve moleküler biyolojide büyük pratik öneme sahiptir. Bakteriyofaj λ aracılı, elektroporasyon ve ısı şoku yöntemleri; transformasyon için kullanılan yöntemlerdir [1,2].
Gelenekselleşmiş transformasyonlara yeni bir alternatif olarak asbest liflerinin kullanımı görülmektedir. Appel ve arkadaşları yaptıkları çalışmada; eksojen DNA'nın memeli hücrelerine alınmasına aracılık eden transfeksiyon ajanları olarak hareket edebilen asbest liflerini, özellikle krizotil lifleri, tanımlamışlardır [1]. Bu yeni yöntemde çalışılan bakteri içerisine ekzojen olarak aktarılmak istenen DNA'ya ait genlerin daha sonra eksprese edildiği gösterilmiş olup; transformasyon yeterliliği ispatlanmıştır [1,3]. Özellikle krizotile benzer silikat minerallerinin viral RNA'nın hücrelere alımını artırabildiği bilinmekte olup; diğer bir mineral ajan olan kalsiyum fosfatın DNA'yı hücrelere transfekte etme yeteneği yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir [3].Yabancı DNA plazmitlerini hücrelere sokmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntem olan kalsiyum fosfat transfeksiyonunda; çalışılan organizma hücreleri tarafından içselleştirilen DNA-kalsiyum fosfat çökeltileri; hemen hemen tüm hücre tiplerinde verimli bir şekilde eksprese edilebilmektedir [4]. Yeni bir transformasyon ajanı olarak kullanılan krizotil liflerin, optimal asbest/DNA oranlarının kullanıldığı standart transfeksiyon deneylerinde en az kalsiyum fosfat kadar etkili olduğu ve plazmit üretiminin gerçekleşleştirilebildiği de gösterilmiştir. Krizotil asbest ile transfeksiyonu yapılan simian virüsü 40 replikasyon orijini taşıyan bir plazmit; yapılan transfeksiyon uygulamasından 24 saat sonra tekrarlanmış ve aktarım sonrası plazmit üretimi teyit edilmiştir [1].
Asbest lifleri ile ilgili elde edilen veriler; bakteriyel mutasyonlara neden olma potansiyeline sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Asbest aracılı uygulanan DNA girişi ve yeni eklenen DNA'nın konak hücre genomuna rastgele yerleştirilmesi, çeşitli mutasyonlara yol açabilir. Bu durumun gerçekleşmesinde etmen olarak; normal büyüme kontrolünün sürdürülmesi için gerekli olan genlerin insersiyonel mutajenez ile inaktive edilebilmesi, konak hücredeki bir protogenin bir promotör yerleştirme mekanizması tarafından aktive edilebilmesi gösterilebilir Asbest ile aktarımın; eksojen DNA'nın prokaryotik hücrelere dahil edilmesinde çeşitli şekillerde mutasyonlara neden olabileceğini ve dolayısıyla evrime katkıda bulunabileceği öngörülmektedir [5].
Yoshida transformasyon tekniği uygulamasında, Esherichia coli (E coli ) plastik bir karıştırma çubuğu kullanarak %2 agar içeren plakalara yayılmış ; sonrasında plakanın yüzeyinde kayma için bir aparat geliştirilerek yayılan krizotil lifleri içeren bir karışım kap yüzeyine yayılmıştır. Uygulama sonrası agar üzerinde döndürme ile uygulanan krizotil liflerinin ekilen bakteri örneği içinde bir sürtünme kuvveti uyguladığı tanımlanmıştır. Koloni oluşturan birimler ile tespit edilen canlı hücre sayısı, krizotil maruziyeti süresiyle orantılı olarak azalırken çalışılan E. coli'nin hücre zarının krizotil penetrasyonu taramalı elektron mikroskop görüntüleri ile görüntülenmiştir. Krizotil liflere maruz bırakılması bakteriler üzerinde kimyasal özelliklerden ziyade penetrasyon ve boyut ve şekil gibi fiziksel süreçlere ve özelliklere bağlıdır. Partiküler yapısı ve nükleik asitleri bağlama yetenekleri sayesinde krizotil lifleri; hücre etkileşimleri yoluyla DNA'yı E. coli'ye sokmak için bir araç olarak transfeksiyon çalışmalarında kullanılmıştır [3,4] .
Şekil 1:E. coli'nin hücre zarının krizotil penetrasyonu taramalı elektron mikroskop görüntülerini temsil etmektedir [6].
Sadece ekilen plakalar üzerine sürülerek değil farklı biçimlerde de krizotil lifleri; plazmit transformasyonu için kullanılmaktadır. Krizotil partiküllere adsorbe edilen ekzojen plasmid DNA, antibiyotik direnç geni içermekte olup, transformasyon sonrası E.coli hücrelerinde antibiyotik direnci göstermesini sağlamıştır [7].
Çalışılacak bakteri ve transforme DNA ile karıştırılan mineral krizotil nanolifler içeren solüsyon; seçici agar plakaları üzerine kaplandığında, agar yüzeyi ile karıştırma çubuğu arasında ortaya çıkan sürtünme kuvvetleri, bakteri hücrelerinin nüfuz etmesine neden olur. Mineral nanoliflere adsorbe edilen transfer edilmek istenen DNA'nın aşılanması bu sayede gerçekleşir [8]. Hedef hücrenin içinde, DNA ‘nın küçük nükleik asitlerle rekabet etmesi, yer değiştirmenin nedeni olarak gösterilebilir [9] Bu rekabet ilişkisine dayanarak transforme edilmek istenen karışıma küçük RNA bileşeni eklenirse, dönüşüm verimi büyük ölçüde azalır. Bu verim azalması, çünkü ekzojen DNA ile ilave edilen RNA’nın rekabet etmesinden kaynaklanır [8].
Elektroporasyon, ısı şoku gibi geleneksel transformasyon tekniklerine yeni ve güncel bir alternatif olarak geliştirilen Yoshida tekniği; öncesinde hiçbir yetkin hücre hazırlığına gerek duyulmaması,herhangi bir fizyolojik durumdaki hücrelerin kullanılabilmesi, prosedürün doğrudan agar plakaları üzerinde gerçekleştirilmesi,hızlı, kolay ve iyi verimlilik sunması yönlerinden pek çok avantaj sunmaktadır [10].
Referanslar
Chen I, Dubnau D (2004). "DNA uptake during bacterial transformation". Nat. Rev. Microbiol. 2 (3). ss. 241-9. doi:10.1038/nrmicro844. PMID 15083159
Yoshida, N., Nakajima-Kambe, T., Matsuki, K., & Shigeno, T. (2007). Novel Plasmid Transformation Method Mediated by Chrysotile, Sliding Friction, and Elastic Body Exposure. Analytical Chemistry Insights, 2, 117739010700200. doi: 10.4137/117739010700200017
Naoto Yoshida, Takayuki Ikeda, Terutoyo Yoshida, Takahumi Sengoku, Kihachiro Ogawa, Chrysotile asbestos fibers mediate transformation of Escherichia coli by exogenous plasmid DNA, FEMS Microbiology Letters, Volume 195, Issue 2, February 2001, Pages 133–137, https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2001.tb10510.x
Kwon, M., & Firestein, B. (2013). DNA Transfection: Calcium Phosphate Method. Methods In Molecular Biology, 107-110. doi: 10.1007/978-1-62703-444-9_10
Hayward, W. S., Neel, B. G., & Astrin, S. M. (1981). Activation of a cellular onc gene by promoter insertion in ALV-induced lymphoid leukosis. Nature, 290(5806), 475–480. https://doi.org/10.1038/290475a0
Yoshida, N., & Saeki, Y. (2004). Chrysotile fibers penetrate Escherichia coli cell membrane and cause cell bursting by sliding friction force on agar plates. Journal Of Bioscience And Bioengineering, 97(3), 162-168. doi: 10.1016/s1389-1723(04)70186-3
Yoshida, N., Saeki, Y. Chestnut bur-shaped aggregates of chrysotile particles enable inoculation of Escherichia coli cells with plasmid DNA. Appl Microbiol Biotechnol 65, 566–575 (2004). https://doi.org/10.1007/s00253-004-1649-8
Tan, H., Fu, L., & Seno, M. (2010). Optimization of Bacterial Plasmid Transformation Using Nanomaterials Based on the Yoshida Effect. International Journal Of Molecular Sciences, 11(12), 4962-4972. doi: 10.3390/ijms11124962
Wilharm, G., Lepka, D., Faber, F., Hofmann, J., Kerrinnes, T., & Skiebe, E. (2010). A simple and rapid method of bacterial transformation. Journal Of Microbiological Methods, 80(2), 215-216. doi: 10.1016/j.mimet.2009.12.002
Rodríguez-Beltrán, J., Elabed, H., Gaddour, K., Blázquez, J., & Rodríguez-Rojas, A. (2012). Simple DNA transformation in Pseudomonas based on the Yoshida effect. Journal Of Microbiological Methods, 89(2), 95-98. doi: 10.1016/j.mimet.2012.02.013