Genetik Kodlanmış Nitrik Oksit Sensörler (geNOps)


Gülşah Sevimli, Sabancı Üniversitesi, Moleküler Biyoloji, Genetik ve Biyomühendislik

Memeliler, bakteriler ve bitkilerde önemli hücresel fonksiyonlara aracılık eden nitrik oksit hakkında çokça araştırma yapılmıştır. [1] Bilim insanları tarafından yapılan çalışmalar ile nitrik oksitin kardiyovasküler (vasküler tonus), sinir (nörotransmisyon) ve bağışıklık sistemleri başta olmak üzere hücrenin fizyolojik ve patolojik süreçlerinde rol oynayan önemli aracı bir molekül olduğu gösterilmiştir. Nitrik oksit memeli hücrelerinde bulunduğu hücre tipi ve fonksiyona uygun olarak nitrik oksit sentaz izoformları (nNOS, eNOS, iNOS) tarafından üretilir. Bu enzimler bulundukları bölgelerin değişen nitrik oksit ihtiyaçlarına göre hızlı ve farklı konsantrasyonlarda nitrik oksit üretebilir. Nitrik oksitin küçük yapılı olması biyomembranlar arasında difüzyonunu kolaylaştırdığından kolayca oksitlenmesine sebep olur. Bu da hücre içerisindeki etkin süresinin kısalması ile sonuçlanır. Nitrik oksitin sahip olduğu radikal yapı diğer biyomoleküller ile etkileşime girmesine olanak sağlar. Ayrıca hücre içerisinde bulunması gerekenden daha az veya çok miktarda olması hücresel faaliyetleri etkileyebilir.


Yapılan çalışmalarda hücre içerisindeki nitrik oksit konsantrasyonunu tespit edebilmek amacıyla spektrofotometrik ölçümler gibi çeşitli teknik ve metotlar kullanılmıştır.[2] Kullanılan bu yöntem ve tekniklerin ayrı ayrı avantajları olmasına rağmen, nitrik oksitin karmaşık metabolizması, göstermiş olduğu düşük konsantrasyon, kısa ömürlü ve radikal özellikleri hücre içerisinde gerçek zamanlı olarak ölçülerek sinyal yolaklarında fonksiyonlarının belirlenmesine yardımcı olamamıştır.


Biyosensörlerin temeli tespit edilmek istenen molekülün (analit), biyosensörde bulunan bu molekülü tanıyacak belirli bir biyoreseptöre bağlanması sonucu ortaya çıkan değişikliğin bir sinyal dönüştürücü (transducer) tarafından kantitatif ya da kalitatif olarak gösterilmesi prensibine dayanır. Genetik olarak kodlanmış biyosensörler hücre içerisindeki sinyal yolaklarının anlaşılması, moleküllerin birbiri ile etkileşimi ve bu etkileşimin hücreye etkisinin gözlemlenmesi için kullanılan biyolojik araçlardır. Genetik kodlanmış biyosensörlerin hücre görüntüleme teknikleri ile oluşturduğu kombinasyon, hücre içerisindeki sinyal yolaklarında gerçekleşen moleküler reaksiyonların anlaşılır hale gelmesinde büyük rol oynamıştır. Bu kombinasyon kullanılarak nitrik oksitin dolaylı ve doğrudan hücre içerisindeki varlığı hakkında bilgi vermesini amaçlayan bazı sensörler geliştirilmiştir.[2] Yapılan biyosensörlerde nitrik oksit konsantrasyonlarının tam olarak saptanamaması, biyosensörün nitrik oksite spesifikliğinin olmaması ya da düşük olması, hücre içerisinde sensörün sebep olduğu toksisite ya da biyosensörlerin hücre içerisinde hedeflenen bölgelerde nitrik oksit ölçümü yapamaması gibi sebepler yıllar boyunca nitrik oksit ölçmek için kullanılacak biyosensörleri geliştirici çalışmalar yapılmasına sebep olmuştur. Hala da gerek nitrik oksit gerek diğer moleküllerin tespit edilebilmesine olanak sağlayacak biyosensörlerin iyileştirilmesi, teknolojinin ve üretilen bilginin gelişimine orantılı olarak devam etmektedir. Bu da biyosensörlerin temel karakterizasyon kavramlarından olan spesifiklik ve hassasiyetinin iyileşmesine olanak sağlamaktadır.


Genetik kodlanmış nitrik oksit sensörleri (geNOps) farklı hücre tiplerinde tek bir hücre içerisindeki nitrik oksit dalgalanmasını gerçek zamanlı olarak doğrudan ölçen oldukça spesifik ve hassas bir biyosensördür. Bu biyosensör nitrik oksit bağlayıcı spesifik bir bölge ve oluşan bu bağlanmayı gösterecek bir floresan proteinin (GFP vb.) kaynaştırılması ile oluşturulmuştur. Bu sensörde Escherica coli NorR transkripsiyon faktörünün nitrik oksit bağlayıcı GAF bölgesi biyoreseptör olarak kullanılmıştır.[3] Bu bölgenin küçük ve basit yapılı olmasının yanı sıra sinyal yolaklarında herhangi bir müdahalesinin bulunmaması,kullanımını uygun hale getirerek biyosensörün sahip olduğu spesifiklikte de büyük bir rol oynamıştır. Bugün laboratuvarda yapılan hemen hemen her çalışmada belirteç olarak kullanılan floresan proteinler genetik kodlanmış nitrik oksit biyosensörlerin temel elemanlarından biridir. Tek bir hücre içerisinde değişen nitrik oksit miktarının espit edilmesinde yardımcı olur.


geNOps’ların çalışma prensibi nitrik oksitin biyosensörün GAF bölgesine spesifik olarak bağlanması sonucu oluşan elektron yoğunluğundan dolayı floresan proteinde meydana gelen değişime dayanmaktadır.[4] Nitrik oksitin hedef bölgeye bağlanması gerçekleştiğinde floresan yoğunluğu azalmaktadır. Tek bir hücrede gerçekleşen bu değişim floresan mikroskobu yardımı ile doğrudan gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilir. Ortamda nitrik oksit konsantrasyonu azaldığında biyosensöre bağlı nitrik oksit miktarı da azaldığından floresan yoğunluğu tekrar artmaktadır. Aynı zamanda floresan mikroskobu ile biyosensörün hücre içerisinde bulunduğu yeri belirlemek de mümkündür. Bu da sensörün hücre içerisinde organeller için kullanılmasının mümkün olup olmadığının araştırılmasını kolaylaştırır. Çalışma sonucu floresan miksroskobundan alınan yoğunluk sonuçları analiz edilerek nitrik oksitin hücre içerisindeki dalgalanması sayısal veriler kullanılarak grafik ile gösterilir.


Farklı dalga boylarında renklere sahip floresan proteinler (cyan, yeşil, turuncu, sarı vb.) GAF bölgesi ile kaynaştırılarak hücre içerisinde verdikleri sinyaller de araştırılmıştır.[1] Bu geNOps’ların çeşitliliğini arttırmakla beraber, aynı anda farklı renkte floresan proteine sahip farklı biyosensörlerin çalışabilmesine olanak sağlayarak nitrik oksitin, kalsiyum gibi etki ettiği moleküller arasındaki ilişkinin de araştırılmasına olanak sağlamıştır.[4] geNOps’ların sahip olduğu bir diğer özellikte yapılarına hedef sekanslar yerleştirilerek hücre içerisinde belirli bölgelerde nitrik oksit değişiminin floresan mikroskobu yardımıyla görüntülenebilmesidir. Böylece tek bir hücrenin farklı bölgelerinde (mitokondri, ER vb.) nitrik oksitin oluşması, degredasyonu ve bulunduğu yerdeki moleküler reaksiyonlara etkisini gözlemlemek mümkün hale gelmiştir. Örneğin, mitokondri hedefli geNOps’lar tasarlanmış ve endotel hücrelerde bu organeldeki nitrik oksit dalgalanması gözlemlenmiştir. [3]


Kısacası, genetik kodlanmış nitrik oksit biyosensörler (geNOps) tek bir canlı hücre içerisinde nitrik oksitin gerçek zamanlı olarak ölçülmesine olanak sağlar. Bu da hücre içerisinde nitrik oksitin oluşumu, degredasyonu ve difüzyonunun gözlemlenerek fizyolojik ve patolojik koşullarda hücre ile olan ilişkisinin gözlemlenmesine yardımcı olur. Bundan sonra bu sensörler kullanılarak yapılan ve yapılacak olan akademik çalışmalar hem bu sensörlerin geliştirilmesi için bir adım olacak hem de hücre içerisinde gerçekleşen nitrik oksite dayalı henüz bilinmeyen hücresel olaylara ışık tutacaktır.







Referanslar

1. Eroglu, E., Hallström, S., Bischof, H., Opelt, M., Schmidt, K., Mayer, B., ... & Malli, R. (2017). Real-time visualization of distinct nitric oxide generation of nitric oxide synthase isoforms in single cells. Nitric Oxide, 70, 59-67.

2. Eroglu, E., Rost, R., Bischof, H., Blass, S., Schreilechner, A., Gottschalk, B., ... & Ramadani, J. (2017). Application of genetically encoded fluorescent nitric oxide (NO•) probes, the geNOps, for real-time imaging of NO• signals in single cells. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (121), e55486.

3. Eroglu, E., Gottschalk, B., Charoensin, S., Blass, S., Bischof, H., Rost, R., ... & Hallström, S. (2016). Development of novel FP-based probes for live-cell imaging of nitric oxide dynamics. Nature communications, 7(1), 1-11.

4. Eroglu, E., Charoensin, S., Bischof, H., Ramadani, J., Gottschalk, B., Depaoli, M. R., ... & Malli, R. (2018). Genetic biosensors for imaging nitric oxide in single cells. Free Radical Biology and Medicine, 128, 50-58.


0 görüntüleme

Türkiye'nin Tek Popüler Genetik Bilim Dergisi

Bezelye Dergi ISSN: 2587-0173

Bizi Takip Et
  • Beyaz Facebook Simge
  • Beyaz Instagram Simge
  • White Twitter Icon
  • Icon-gmail
  • kisspng-white-logo-brand-pattern-three-d
  • images
  • medium
  • Dergilik
  • YouTube

© 2019 by Bezelye Dergi