Genetik Materyal Aktarım Yöntemleri


Yaşar Yurtsever – İTÜ, Moleküler Biyoloji ve Genetik

Gen mühendisliği çalışmalarında kullanılmak üzere hazırlanan genetik materyaller, genellikle fiziksel, kimyasal ve viral olmak üzere üç farklı yol ile aktarılırlar. mRNA, DNA, gibi en bilinenleri ve siRNA veya miRNA gibi küçük gen parçaları bu üç yöntem ile rahatlıkla aktarılabilir ancak ribonukleoproteinler gibi direk protein aktarımı için viral yöntemler uygun değildir. Ancak, virüsler kendi genetik sekanslarını bulaştırmak için milyonlarca yıldır süregelen bir adaptasyon geliştirmişlerdir ve bu işi yapmak üzere evrimleşmişlerdir. Bu sebepten ötürü fiziksel ve kimyasal yöntemler viral yöntemler kadar verimli gen aktarımı (DNA ve RNA gibi) yapamazlar ve virüsler kadar dokuya özel hareket edemezler.[1]


Her yöntemin kendine göre avantajı ve dezavantajı vardır. Ancak ilerleyen teknoloji ve bilgi birikimi sayesinde bu sorunlar aşama aşama çözülmeye devam etmektedir. Fiziksel yöntemeler genellikle hücre kültürleri ve embriyoya gen aktarımı yapılmak istendiğinde kullanılır. Dokuya özel bir fiziksel aktarım metodu yoktur bu sebeple direk canlı vücuduna genetik materyali vermek (naked DNA veya mRNA) çeşitli sorunlara sebep olabilmektedir. Fiziksel yöntemeler arasında en çok kullanılan yöntemler mikroenjeksiyon ve elektroporasyondur. Mikroenjeksiyon camdan yapılmış bir mikro iğne yardımı ile genetik materyalin aktarılmasını sağlar. Bu aktarım yöntemi ile ayrıca kimyasal ve viral yöntemlerle sarılmış gen dizileri de aktarılabilir. Elektroporasyon yönteminde zarlara elektriğin gücü kullanarak hücrenin zarları genişletilir ve hem DNA ve mRNA gibi zincir sekanslar hem de proteinler gönderilebilir.[2] Bu yöntemler haricinde hidrodinamik aktarım yöntemi -su basıncı yardımı ile aktarılır- gibi alternatif fiziksel yöntemler de vardır.[3]

Kimyasal aktarım yöntemleri organik ve inorganik olarak iki parçada incelenebilir. Organik aktarım yöntemlerin temelini yağ tabanlı bileşikler oluşturur. Yağdan yapılan zarlar özellikle fosfolipit kökenli olanlar canlıların hücre zarları ile de benzer oldukları için kolaylıkla giriş yapabilirler. Virüs temelli aktarım yöntemlerinin hücre için zararlı yan etkilerinin fazla olması ve biyogüvenlik problemleri, genetik materyalleri istenmeyen bölgelere entegre etmesi, üretim maliyetleri gibi bazı sorunlar sebebiyle yağ temelli tabakalar üzerine yapılan araştırmalar hız kazanmıştır.[4]


Yağ temelli tabakalar arasında en güvenilir sonuç veren tabakalardan biri katyonik lipitlerdir. Nükleotidler negatif yüklüdürler bu sebeple pozitif yüklü olan bu lipitler bu ipliklerin etrafını rahatlıkla sarabilirler. Lipit zarların en büyük problemi tıpkı fiziksel yöntemler gibi dokuya özel hareket edememesidir. Bu sebeple genellikle aktarılmak istenen dokuya yakın damardan kan yolu ile verilirler, ancak yakın zamanda yapılan bir çalışmaya göre 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP) ile sarılı katyonik lipitler farklı konsantrasyonlardaki DOTAP’a göre farklı dokuları tercih etmektedirler. Örneğim %10 luk bir DOTAP ile hazırlanan katyonik lipitler karaciğere hedeflenebilirken, %50’lik DOTAP ile hazırlananlar çoğunlukla akciğere gitmektedirler. Ayrıca katyonik lipitlerin geniş hacimli olabilmesi sayesinde direk protein yapılar halinde aktarım da yapılabilir. Örneğin Cas9 ile yapılan gen terapilerde Cas9 ve hedef sekansı taşıyan rehber RNA aynı katyonik lipit üzerinden aktarılarak merkezi dogma süreçlerini de atlamış olur ve bu aşamalar arasında yaşanabilir olan sorunların önüne geçmekle kalmaz daha hızlı ve rehber RNA’ya bağlanmak için uğraşması gereken ihtimaller de ortadan kaldırılmış olur. Bu sayede daha etkili bir gen terapi sağlanabilir.[5]



Şekil 1: Düşük ve yüksek miktardaki DOTAP farklı dokulara özgü olmasını sağlar örneğin buradaki 5A2-DOT-10 karaciğere özgü iken 5A2-DOT-50 akciğere özgüdür.[5]

Organik zar yapıları haricinde birde inorganik zarlar vardır. Bunlar genellikle altın ve gümüş kullanılarak hazırlanırlar ve prosedürleri ve protokolleri genelde lipit tabakalara benzerdir. Özellikle altın nanoparçacıklar ile oluşturulan zarlar etkili olarak çalışılmaktadır ve potansiyelleri çok yüksektir. Tıpkı lipitler gibi inorganik nanoparçacıklar da protein taşıyabilirler ve CRISPR gen tedavi yöntemleri için alternatif olarak kullanılmaktadırlar. Örneğin Lee ve ekibi tarafından yapılan çalışmada beyindeki çoklu tekrarlar yüzünden oluşan genetik bir hastalık olan kırılgan X sendromunu bir fare üzerine Cas9’ı protein formunda vererek başarılı bir şekilde tedavi edebilmiştir.[6]


Günümüzde en çok kullanılan yöntemlerden biri virüslerdir. Virüsler sıklıkla evrim geçirirler, kendilerine uygun hedef dokulara bulaşırlar ve onlarda çoğalırlar. Virüslerin özellikle dokuya özgü olarak hareket edebilmeleri gen mühendisliği için inanılmaz fırsatlar sunmuştur. Örneğin CRISPR yöntemi virüslerin genetik materyallerini bakteriye aktarıp onları kullanması (bakteriyofajlar) durumuna karşı bakteriler tarafından geliştirilen bir savunma mekanizmasıdır. Gen mühendisleri bu yöntemi kendi istedikleri duruma benzeterek çeşitli yöntemler geliştirmişlerdir. Gen mühendisliği çalışmalarında adenovirüsler ve adeno-ilişkili virüsler DNA aktarmak için yaygınca kullanılır. Bu virüsler haricinde retrovirüsler ve (lentivirüsler RNA taşıyan virüsler) istenilen genomu uygun yerine entegre etmek için kullanılırlar. Ancak her virüsün de kendi içlerinde bazı limitleri vardır. Örneğin, adeno-ilişkili virüslerin kapasiteleri çok küçüktür (yaklaşık olarak 4.8-5 kb) ve çoğalabilmeleri için adeovirüs gibi yardımcı virüslere ihtiyaç duyarlar, ancak toksisitelerinin düşük olması ve hemen hemen her dokuya özel bir alt tipinin bulunması sebebiyle en yaygın kullanılan virüs tiplerinden biridir.[7] Lentivirüs gibi retrovirüsler genellikle çok toksiktirler ve entegrasyonlarını engellemek zordur. Ancak gen entegresi yapılması gereken yerler için kullanılabilecek en etkili virüslerden biridir.[8] Adenovirüsler boyut olarak çok büyüktürler ve fazlasıyla yer sağlayabilirler ancak toksik etkileri çok fazla olduğu için diğer virüsler kadar yaygın kullanılmazlar.[9]



Referanslar

  1. Glass, Z., Lee, M., Li, Y., & Xu, Q. (2018). Engineering the Delivery System for CRISPR-Based Genome Editing. Trends in Biotechnology, 36(2), 173-185. doi: 10.1016/j.tibtech.2017.11.006

  2. Bamford, R., Zhao, Z., Hotchin, N., Styles, I., Nash, G., Tucker, J., & Bicknell, R. (2014). Electroporation and Microinjection Successfully Deliver Single-Stranded and Duplex DNA into Live Cells as Detected by FRET Measurements. Plos ONE, 9(4), e95097. doi: 10.1371/journal.pone.0095097

  3. Camarillo E., R., Padilla M., J., García M., J., Ocón D., C., Reyes C., C., Camarillo E., J., & Rodríguez R., R. (2016). Auto-Calibration and Micro-Flow Injection Procedure Based on Automated Hydrodynamic System for Spectrophotometric Determination of Cobalt. Emerging Challenges For Experimental Mechanics In Energy And Environmental Applications, Proceedings Of The 5Th International Symposium On Experimental Mechanics And 9Th Symposium On Optics In Industry (ISEM-SOI), 2015, 255-263. doi: 10.1007/978-3-319-28513-9_36

  4. Petrilli, R., Eloy, J., de Souza, M., Abriata Barcellos, J., Marchetti, J., Yung, B., & Lee, R. (2016). Lipid nanoparticles as non-viral vectors for siRNA delivery. Nanobiomaterials In Drug Delivery, 75-109. doi: 10.1016/b978-0-323-42866-8.00003-4

  5. Wei, T., Cheng, Q., Min, Y., Olson, E., & Siegwart, D. (2020). Systemic nanoparticle delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins for effective tissue specific genome editing. Nature Communications, 11(1). doi: 10.1038/s41467-020-17029-3

  6. Lee, B., Lee, K., Panda, S., Gonzales-Rojas, R., Chong, A., & Bugay, V. et al. (2018). Nanoparticle delivery of CRISPR into the brain rescues a mouse model of fragile X syndrome from exaggerated repetitive behaviours. Nature Biomedical Engineering, 2(7), 497-507. doi: 10.1038/s41551-018-0252-8

  7. Naso, M., Tomkowicz, B., Perry, W., & Strohl, W. (2017). Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy. Biodrugs, 31(4), 317-334. doi: 10.1007/s40259-017-0234-5

  8. Yaniz-Galende, E., & Hajjar, R. (2014). Stem cell and gene therapy for cardiac regeneration. Cardiac Regeneration And Repair, 347-379. doi: 10.1533/9780857096708.4.347

  9. Ryu, W. (2017). Adenoviruses. Molecular Virology Of Human Pathogenic Viruses, 111-124. doi: 10.1016/b978-0-12-800838-6.00008-4

77 görüntüleme

Türkiye'nin Tek Popüler Genetik Bilim Dergisi

Bezelye Dergi ISSN: 2587-0173

Bizi Takip Et
  • Beyaz Facebook Simge
  • Beyaz Instagram Simge
  • White Twitter Icon
  • Icon-gmail
  • kisspng-white-logo-brand-pattern-three-d
  • images
  • medium
  • Dergilik
  • YouTube

© 2019 by Bezelye Dergi