Genom Düzenleme

En son güncellendiği tarih: 21 Nis 2019


Yeşil Scipubs Ekibi

DNA dizilimi, laboratuvarlarda kullanılan önemli bir teknik olup DNA’da yer alan baz sırasının belirlenmesidir. DNA dizilimi için çok çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Bu yöntemler temelde klasik ve yeni nesil dizileme olarak sınıflandırılmaktadır. Klasik yöntemlere, Sanger ve Maxim Gilbert yöntemleri örnek verilebilir. Klasik yöntemler ile dizilemenin çok zaman alması, uğraştırıcı olması, maliyetli olması ayrıca bilimsel çalışma sayısının artması gibi sebeplerden yeni yöntemlere ihtiyaç duyulmuştur. Teknolojinin gelişmesi ile de yeni nesil dizilimler keşfedilmiştir. Yeni nesil dizileme teknolojilerine Illumina, Ion Torrent, Roche, PacBio Real Time Sequencing, Helicos ve Oxford Nanopore örnek verilebilir. Yeni nesil genom dizileme teknolojileri ile geniş kapsamlı analizler daha kısa sürede ve maliyette gerçekleştirilmektedir. Pratik ve kolay uygulanabilir olması açısından yeni nesil dizileme, birçok hastalığın tanı ve tedavisinde kullanılmaktadır. Yeni nesil gen düzenlemeyle baz ya da gen dizisinde herhangi bir değişiklik olması, mutasyon meydana gelmesi ya da olması gerekenden farklı bir durum gerçekleşmesi gözlemlenebilmektedir. Hastalığın genetik temelini tespit edince tedavi için DNA’da belirli değişiklikler ya da düzenlemeler yapılmasına “genom düzenleme” denir. Canlı hücrelerin genomlarında spesifik DNA dizilerinin hedeflenen modifikasyonunu kolaylaştırmak için tasarlanan genom düzenleme, hücre içindeki DNA’nın hatasız ve verimli şekilde modifiye edilmesi için kullanılan bir tekniktir. Bu teknolojilerin yaygın olarak kullanılması ve araştırma konusu haline gelmesinde, özelleştirilebilme kolaylığı ve çoklu hücre tiplerinde uygulanması etkili olmuştur. Genom düzenlemede bir dizi spesifik nükleazlar kullanılır. Bu nükleazlar DNA kesim (restriction) enzimlerine benzer şekilde, genomda düzenleme yapılmak istenen bölgede DNA’yı çift iplikli olarak keser. Oluşan bu çift iplik kesikleri, hücrenin DNA tamir mekanizmaları olan Homolog Rekombinasyon (Homologous Recombination - HR) ya da Homolog Olmayan Uçların Birleşmesi (Non-Homologous End Joining - NHEJ) yoluyla tamir edilirken, hücre tarafından hangi tamir mekanizmasının kullanıldığına bağlı olarak genomda farklı modifikasyonlar meydana gelir.


Dizi Spesifik Nükleazlar(ZFN, TALENs, CRISPR)


Dizi spesifik nükleazlar; Çinko Parmak Nükleazları (Zinc Finger Nucleases - ZFN), Yazım Etkinleştirici Benzeri Etkileyici Nükleazlar (Transcription activator-like effector nucleases - TALENs), Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Yinelemeler ( Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats - CRISPR) ve meganükleazlardır.


Genom hedefleme teknikleri -belirli bir dizinin başka yerlerde gen kopyalarının yerleştirilmesinden ziyade normal genomik konumdaki hedefe yönelik modifikasyon- ratlarda germline mühendisliği için 1980’lerde öncü olmuştur. Bu ilk çalışmalar, geleneksel gen transfer metotlarına göre gen hedeflemenin bilimsel avantajları üzerine birçok araştırmayı ve düşünceyi geliştirmiştir. ZFN, TALENs ve meganükleazlar 2010 yılına kadar süren çalışmaların geliştirilmesiyle sonuçlanmıştır. Memeli hücrelerinde RNA güdümlü bir nükleazın özellikle hedef dizileri ayırdığı ve kesin genom modifikasyonu için yeni bir yaklaşım sağladığı 2013 yılı başlarında gösterilmiştir. Günümüze kadar diğer bakteri türlerinden ilave RNA güdümlü nükleazlar tanımlanmış ve genom düzenleme olarak potansiyelleri araştırılmaktadır.


ZFN


Tek tek ele almak gerekirse, ZFN’ler kullanıcının genomda modifiye etmek istediği bölgeye göre dizayn edilen ilk dizi spesifik nükleazlardır. ZFN etkili, hedeflenmiş nükleazların ilk aşamasını temsil eder. ZFN serileri ZFN oluşumu için spesifik gen lokusuna bağlanmayı tasarlar ve daha sonra fokl nükleazıyla kaynaştırılır. Komşu iki bölgeyi tanıyan eşleştirilmiş ZFN’ler DNA’yı ikiye böler ve HDR başlatılır. Uzun sentez süresi ve modüler olmayan birleşim işlemi nedeniyle ZFN’lerin kullanımı sınırlandırılır. Bilişim aletleri hedefleme mekanizmasının gelişimine yardımcı olmasına rağmen her genomik lokusa uygun ZFN çiftleri tasarlamak mümkün değildir.


TALENs


Dizi spesifik nükleaz ailesinin ikinci üyesi olan TALEN sistemi ZFN sistemine bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. İlk kez 2011 yılında rapor edilen TALEN’ler genom mühendisliğinde büyük çığır açmıştır. Bu modüler sistem fokl endonükleazıyla kaynaştırılan Xanthomonas spp’den izole edilmiş TAL etkileyici DNA bağlayıcı proteinlerden temel alır. Addgene’nin en gözde kiti haline gelen Golden Gate TALEN kitiyle birlikte TALEN teknolojisi, araştırma topluluğu tarafından hızla benimsenmiştir. TALEN’lerin ihtiyaca göre düzenlenebilen DNA bağlama özellikleri ayrıca gen aktarımının ayarlanması için özel transkripsiyon faktörlerinin tasarımına imkan sağlamıştır.


CRISPR

CRISPR, kullanıma başlanmasıyla genom mühendisliği çalışmaları oldukça hızlanmış olup bitki biyoteknolojisinde de çığır açmıştır. CRISPR’ın çalışma prensibi RNA aracılı (rehber RNA – Guide RNA – gRNA) nükleazlara dayanır. En yaygın kullanılan sistem, Streptococcus pyogenes’de keşfedilen CRISPR/Cas9 ( CRISPR İlişkili Protein 9 - CRISPR Associated protein 9) sistemidir. CRISPR sistemi bakteri ve arkelerin kendi genomlarını korumaya yönelik bağışıklık sistemlerinin bir parçasıdır. Bu sistem yabancı DNA’yı sekansına bağlı olarak keser, bakteri ve arkeleri istilacı nükleik asitlerden (virüsler gibi) korur.


CRISPR/Cas9 ayrıca bir organizmada birden fazla lokusu hedefleyebilir ve TALEN’ler gibi, bu sistem aynı zamanda diğer işlevlere de uyarlanmıştır. Hatta her hafta yayımlanan bu teknoloji kullanılarak elde edilen yeni belgelerle CRISPR’lar araştırma topluluğuna TALEN’lerden daha kolay ulaşılabilir.


Kaynak : https://www.mobitec.com

Meganükleaz


Meganükleaz teknolojisi ise doğal olarak meydana gelen ana nüklezların DNA bağlanma özgüllüğünün yeniden düzenlenmesiyle ilişkilidir. Meganükleazlar yeniden düzenlenmiş nükleazlar içerisinde en küçük sınıftır. Bu da onları tüm standart gen devretme metotlarına uyumlu hale getirmektedir.

İyi karakterize edilmiş ve genellikle I-CreI ve I-SceI enzimlerini kullananan LAGLIDADG ailesi, ana nükleazların en geniş sınıfıdır. Oranlı tasarım ve seçim kombinasyonları sürecinde bu ana nükleazlar yeni sekansları hedeflemek üzere yeniden düzenlenebilir. Çoğu çalışmada meganükleazlar genom düzenlenme konusunda ümit verirken, ana nükleazların DNA bağlanma ve ayrılma alanlarını birbirinden ayırmanın güç olması, bu yöntemin kullanımını sınırlandırmaktadır. Bu sınırlılıktan dolayı ZFN ve TALEN’lerin yeniden düzenlemede meganükleazlara göre daha avantajlı olduğu belirtilmektedir.


Hedeflenmiş gen düzenlemesi belli bölgeye özgü DNA’yı ayırırken, kalan genomun zarar görmesini önlemeye ve korumaya dayanır. Bu nedenle hedeflenmiş nükleazlar majör odak noktasıdır. 2 zorunlu heterodimer gereksinimiyle fokl dimerizasyonu hedef DNA’ya bağlanmak üzere spesifik oryantasyon ve açılmayı sağlamak üzere ZFN ve TALEN’lerin özgüllüğünü ciddi derecede arttırmaktadır.

ZFN ve TALEN’lerin yapısını andıran, Cas9 nikaz ya da Cas9-fokl füzyonu oluşturmak üzere Cas9 nükleaz alanının inaktivasyonu 2 gRNA/Cas9 kompleksine ihtiyaç duyarak özgüllüğü yükseltmiştir. Ek olarak gRNA ve hedefteki tamamlayıcı alanın 20 nükleotidden 17’ye düşürülmesiyle S. Pyogenes’den elde edilen Cas9’un özgüllüğünü arttırmıştır. Son zamanlarda yapı destekli protein mühendisliği tarafından özgüllüğü arttırılmış yeni Cas9 varyantları üretilmektedir. Tüm bu çalışmalar, CRISPR/Cas nükleazların özgüllüğü hakkındaki başlangıçta var olan endişeleri belirgin bir biçimde azaltmıştır. Bununla birlikte nükleaz teknolojisi gözetilmeksizin, kompleks bir genomdaki hedef ayırmada bütün spektrumu belirlemek zordur. DNA bağlanma özgüllüğü sorusuna ChIP-seq, anlaşılabilir hedef alan tanınması için yeterince bilgilendiricidir. Fakat büyük çoğunluğu hedef olmayan bağlanma bölgeleri nükleaz aktivitelerinin öngöremeyeceği alanlardır.


MAGESTIC


Gen düzenleme sürecini daha kusursuz bir hale getirmek amacıyla yapılan çalışmalar sürmektedir. Joint Institute of Metrology and Biology (Stanford University ve National Institute of Standards and Technology işbirliği) araştırmacıları tarafından yeni bir tür CRISPR platformu olan MAGESTIC (multiplexed accurate genome editing with short, trackable, integrated cellular barcodes - kısa, izlenebilir, bütünleştirilmiş hücresel barkodlarla arttırılmış uygun genom düzenleme) geliştirilmiştir. Bir tür maya olan Saccharomyces cerevisiae’den elde edilen MAGESTİC ile genetik materyalde CRISPR’dan daha hassas ve etkin bir ayrılma sağlanması hedeflenmiştir. Nature Biotechnology’de yapılan yayında MAGESTİC ile gen düzenleme sürecinde hücre sağ kalımının yedi kat arttığı belirtilmektedir.


MAGESTİC’i daha önceki arttırılmış CRISPR düzenlemesi yaklaşımlarından ayıran bir diğer özellik ise yeni bir tür hücresel barkoddur.


Araştırmacılar gelenekselci yaklaşımla plasmid olarak bilinen sirküler DNA’nın küçük parçalarını RNA’ya rehberlik yapması ve her hücrede tasarlanmış mutasyonları izlemek üzere barkodları depolamaları için kullanmıştır. Plasmidler hücre büyüdükçe sayıca artmış ve hücre bölündükçe kalıtılmıştır. Teorik olarak bunlar ödeme standlarındaki siyah beyaz barkodlar gibi çalışmalıdır. Plasmid barkod sayıları her hücrede 10-40 arasında geniş bir aralıkta bulunduğundan hücreler arası zenginlikte uyumsuzluk oluşturmuştur. MAGESTIC’de ise barkodlar bunun yerine kromozomlara entegre edildiğinden daha stabil ve daha sonra bulması ve sayması kolay hale gelmiştir.


Kısa Özet (Çalışma Prensipleri)

Genom düzenleme teknolojilerinin tümü aynı prensiple çalışır. Tek tek genler veya kodlama yapmayan bölgeler için spesifik DNA dizilerini daha sonra dizileri tanıyan, bağlayabilen ve tek iplikli yahut çift iplikli DNA kopmaları oluşturabilen DNA hedefleridir. Örneğin, bir CRISPR "rehber RNA" ile birlikte bir Cas9 proteini, bir hücrenin genomundaki binlerce gen arasında bir hedef gen bulabilir ve hedef bölgedeki her iki DNA şeridini parçalayabilir. Bu, hedef gende bir mutasyon oluşturmak veya düzenlemek için yararlanılabilecek bölünme olayıdır. Hücrenin normal DNA onarım mekanizması daha sonra DNA kopmasını tamir etmeye çalışır. Bu işlemin sonucunda genellikle hedef bölgede bazı DNA dizilerinin silinmesiyle mutasyon oluşur. Ayrı olarak tasarlanmış bir “donör” DNA fragmanı sağlamışsa, onarım mekanizmaları bunu DNA kopmasını düzeltmek için bir şablon olarak kullanabilir ve böylece, tasarlanmış DNA molekülü yeni dizilerin hedef alana girmesine izin verebilir. Bu son işlem birçok potansiyel genom düzenleme uygulamasının anahtarıdır. Çünkü donör DNA fragmanı önceden var olan zararlı mutasyonun veya alternatif olarak yeni, faydalı bir varyantın yerini almak üzere normal bir sekans taşıyabilir. Bu şekilde, hastalığa neden olan mutasyonlar potansiyel olarak düzeltilebilir veya gen fonksiyonunu, hastalığı önleyecek veya tedavi edecek şekilde değiştirmek için yeni mutasyonlar eklenebilir. Böylece, genleri laboratuvarda veya hatta canlı hayvan dokularında düzenlemek hedeflenebilir. Aslında, tasarlanmış nükleazların, birçok memelide olmak üzere çok çeşitli organizmalarda etkili olduğu gösterilmiştir.


Klinik Kullanımı


İnsan hücrelerinde de genom düzenlemesi uygulanabilir. HIV enfeksiyonu, orak hücreli anemi ve kanser gibi hastalıklar için hayat kurtarıcı tedaviler sunabilecek hücre bazlı insan terapötiklerinin geliştirilmesinde genom düzenleme araçlarının kullanılmasına büyük ilgi vardır ve bu çalışmalar umut vadetmektedir. MAN2A1-FER olarak adlandırılan bir füzyon geni hedeflenerek ilk gen düzenleme özel olarak kanser füzyon genlerini hedef almak için kullanılmıştır. Ayrıca herediter kanserlerde genom düzenleme çalışmaları devam etmektedir.


CRISPR-Cas9 sistemiyle kistik fibröz hastalarından kültüre edilen hücrelerde CFTR geninin tamiri ile ilgili çalışmalar yapılmıştır. Fare eşey hücrelerinde DNA’yı değiştirerek, dominant katarakt bozukluğu, Tirozinemi tip 1, Duchenne kas distrofi hastalıklarının iyileştirilmesiyle ile ilgili araştırmalar yapılmıştır. Cas9 aynı zamanda viral enfeksiyonların tedavisinde de kullanılma potansiyeline sahiptir ve HIV ve Hepatit B virüsleri için bu sistemin kullanılabilirliği gösterilmiştir. Retinitis pigmentosa, kardiyomiyopatiler gibi patolojiler, kalıtsal kanser, mitokondriyal DNA hastalıkları, nörolojik hastalıklar, böbrek hastalıkları, bağ dokusu hastalıkları, immün yetmezlikler, körlük, sağırlık ve Lynch sendromu, BRCA1 ve BRCA2 genleri ile ilişkili meme ve over kanserleri gibi odaklanabilecek belirli tiple ilişkili kanserler ile ilgili çalışmalar sürmektedir. CRISPR-Cas sistemi ile kazanılan bağışıklığın kalıtsal olarak aktarılması, bu sistemin önemli bir avantajıdır. Genom kurgusunun birçok türün embriyosunda çalışıldığı bilinmektedir.