Genotoksisite Testleri

En son güncellendiği tarih: Nis 25


Seda İpek, Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi-Eczacı/Farmasötik Toksikoloji Anabilim Dalı Yüksek Lisans Öğrencisi


DNA nedir?


DNA (Deoksiribo Nükleik Asit), bütün organizmalarda (bazı virüsler de dahil) canlılık işlevleri ve biyolojik gelişmenin sağlanması için gerekli olan, içerisinde genetik talimatların yer aldığı nükleik asittir. DNA nükleotit adı verilen birimlerden oluşur ve polimer yapısındadır.


DNA polimeri milyonlarca nükleotitten oluşmaktadır. Bir nükleotit birimi 3,3 Angström (0.33 nanometre) uzunluğundadır. DNA zincirinin genişliği ise 22-26 Angström (22-26 nanometre) arasındadır. DNA molekülü; protein ve RNA molekülünün yapımı için gerekli bilgiyi bünyesinde taşımaktadır. Genetik bilgilerin yer aldığı DNA parçaları gen adını alır. DNA’nın bilgiyi uzun süreli saklama rolü dışında; kromozomların şekillerini belirleme, genetik bilginin hangi hücrelerde, hangi şartlarda kullanılacağını düzenleme rolü de bulunmaktadır. İki uzun polimerden oluşan DNA zincirinin omurgaları, ester bağları ile birbirine bağlanmış şeker ve fosfat gruplarından meydana gelir. Her bir şeker grubuna baz adı verilen dört farklı molekülden biri bağlanır. Omurga boyunca bazların oluşturduğu dizi, genetik bilgiyi kodlar. Protein sentezi sırasında bu genetik bilgi, proteini oluşturan amino asitlerin dizisini belirlemektedir.



Hücrelerdeki DNA, kromozom adı verilen yapıların içinde yer almaktadır. Hayvan, bitki, mantar ve protistalar (ökaryotik canlılar) DNA ‘larını hücre çekirdeği içinde bulundururken; bakteri ve arkelerde (prokaryotik canlılar) ise DNA hücrenin sitoplazmasında yer alır. Kromozomda bulunan histon proteinleri DNA yapısını sıkıştırıp organize eder. Bu sayede DNA’nın hangi kısımlarının okunması gerektiği kontrol edilmiş olur.


DNA molekülü çift sarmal adı verilen, birbirine sıkıca sarılı çift molekülden oluşur. DNA’nın yapısında yer alan şeker molekülü pentoz olup (beş karbonlu şeker) 2-deoksiriboz olarak adlandırılır. Şeker moleküllerini birbirine bağlayan fosfodiester bağları asimetrik yapıdadır. Bu yüzden DNA çift sarmalda yer alan nükleotitlerin birbirine bağlanma yönü, öbür iplikte yer alan nükleotitlerin yönünün tersidir. DNA ipliklerinin bu yönüne anti-paralel denir ve asimetrik olan uçlar 5’ (beş üssü) ve 3’ (üç üssü) olarak adlandırılır. 5’ uç bir fosfat grubu taşırken, 3’ uç ise hidroksil grubu taşır.


Çift sarmalda yer alan bazlar arasındaki zayıf hidrojen bağları DNA’yı stabilize eder. Her bir şeker grubuna bağlanan DNA bazları; adenin(A), timin(T), sitozin (C) ve guanindir (G). Adenin ve guanin, beş ve altı üyeli halka sisteminin kaynaşmasından oluşan pürin türevi iken; sitozin ve timin ise altı üyeli bir halkadan oluşan pirimidin türevidir. DNA’nın bir ipliğinde yer alan baz tipi, öbür iplikteki tek bir baz tipi ile bağ kurar. Adenin bazı timin ile, guanin bazı ise sitozin bazı ile bağ kurar. Kurulan bu baz eşleşmesine, tümleyici (komplemanter) baz eşleşmesi denir. Tümleyici baz eşleşmesi sonucunda bir DNA sarmalındaki iki iplikli dizideki tüm bilgi ipliklerin her birinde kopyalanmış durumdadır. Komplemanter baz çiftleri arasındaki spesifik ve tersinir etkileşimler DNA’nın canlılardaki işlevleri için şarttır. Ayrıca baz çiftleri arasında meydana gelen hidrojen bağının sayısı da farklıdır. Adenin ve timin arasında iki hidrojen bağı; guanin ve sitozin arasında ise üç hidrojen bağı oluşur. Bu yüzden iki DNA ipliğinin birbirine bağlanma gücünü belirleyen hem DNA çift sarmalının uzunluğu hem de guanin-sitozin baz çiftinin yüzde oranıdır. Özellikle DNA çift sarmalının kolay ayrılması gereken bölgelerde adenin-timin oranı daha yüksek olur.


DNA’nın çeşitli konformasyonları mevcuttur. Bu çeşitli konformasyonlardan; A-DNA, B-DNA, Z-DNA canlılarda bulunmuştur. B-DNA, canlılarda en sık görülen DNA biçimidir. A-DNA ise B biçimine göre daha geniş bir sarmala sahiptir. Özellikle fizyolojik olmayan şartlarda, suyunu kaybetmiş DNA örneklerinde görülür. Hücre içinde ise DNA-RNA; DNA- enzim komplekslerinde meydana gelebilir. Metilasyonla kimyasal değişime uğrayan DNA parçaları daha büyük biçimsel değişiklik göstererek Z biçimini alabilir. Z-DNA bağlayıcı proteinler tarafından tanınan bu yapıların, transkripsiyon kontrolü ile ilişkili olduğu düşünülmektedir.


İnsan hücrelerinde genelde TTAGGG dizisinin birkaç bin kere tekrarından oluşan tek iplikli DNA uzantıları bulunur. Bu yapılara telomer adı verilir. Telomerler doğrusal kromozomların uçlarında yer alan özelleşmiş bölgelerde bulunur. Bu bölgelerin esas görevi telomeraz enzimi ile kromozom uçlarının kopyalanmasını sağlamaktır. Çünkü DNA kopyalama görevinde yer alan enzimler kromozomların uçlarını kopyalayamadığı için telomeraz enzimine ihtiyaç duyulur. Ayrıca bu özelleşmiş bölgeler DNA’nın uçlarını korur ve hücredeki DNA onarım mekanizmasının bunları onarması gereken hasar olarak algılanmasını engeller.


DNA hasarı ve sınıflandırılması


Çeşitli mutajenlerin etkisi ile DNA dizisi değişebilir ve DNA molekülünde hasar meydana gelebilir. DNA dizisinde değişiklik yapan mutajenler arasında başlıca; oksitleyici etmenler, alkilleyici etmenler ve yüksek enerjili elektromanyetik ışınlar (morötesi, X ışını) sayılabilir. DNA’da oluşan hasarın türü ise etki eden mutajene bağlıdır. Serbest radikaller, hidrojen peroksit gibi oksitleyici maddeler baz değişimi ve çift zincir kırıklarına neden olurken; mor ötesi ışın siklobütan piridin dimerleri ve 6,4 fotoürünleri ile DNA’ya hasar verir. DNA’da meydana gelen yükseltgeyici hasarlardan en zararlısı çift zincir kırıklarıdır, çünkü bunların onarımı zordur. Ayrıca bu kırıklar DNA dizilerinde noktasal mutasyonlara, insersiyonlara, delesyonlara ve kromozomal translokasyonlara neden olabilir.


Birçok mutajen madde, iki baz çifti arasındaki boşluğa girer. Bu duruma enterkalasyon adı verilir. Enterkalatörler olarak bilinen moleküllere örnek olarak; etidyum bromür, daunomisin ve doksorubisin verilebilir. Eğer DNA sarmalı normalin aksi yönünde burularak gevşerse, enterkalatör molekül iki baz çifti arasına girebilir. Bu durum gerçekleştiğinde transkripsiyon ve DNA ikilenmesi engellenir, zehirlenme ve mutasyonlar meydana gelir. Bu yüzden enterkalatörlerin çoğu kanserojendir ve en iyi bilinen örnekleri; benzopiren diol epoksit, aflatoksin ve etidyum bromürdür. Ayrıca bu moleküller DNA transkripsiyonuna engel olma özelliklerinden dolayı kemoterapide kanser hücrelerinin büyümesini engelleme amacıyla kullanılır.


DNA hasarı sınıflandırılması:


- Apürinik bölgede oluşan hasar

- Alkilasyon sonucu oluşan hasar

- Enterkalasyon sonucu oluşan hasar

- Apirimidinik bölgede oluşan hasar

- Radikal oluşumuyla oluşan hasar

- Tek zincir kırıkları

- Büyük moleküllerin adakt hasarı

- Pirimidin dimerler oluşum hasarı

- Fosfotriester oluşum hasarı

- Baz hasarı

- Çift zincir kırıkları

- Zincir içi çapraz bağlarda hasar

- DNA-protein çapraz bağı hasarı


DNA hasarı onarım mekanizmaları


DNA onarım mekanizmalarının aydınlatılması özellikle klinik kullanım açısından önemlidir. DNA onarımında yer alan genler iki grup altında toplanabilir:


a) DNA onarımında sinyal iletimi ve onarımın düzenlenmesi ile ilgili genler

b) Hatalı eşleşme onarımı, baz ve nükleotit çıkarma onarımı ile ilgili genler

DNA onarım mekanizmaları ise başlıca beş grupta toplanır:

1) Direkt onarım ya da hasarın geri döndürülmesi: Fotoreaktivasyon, O-6-metilguanin onarımı, basit tek zincir kırıklarının ligasyonu

2) Eksizyon onarımı: Baz ekzisyon onarımı (BER),nükleotit eksizyon onarımı (NER), yanlış eşleşme eksizyon onarımı (MER)

3) Rekombinasyonal onarım

4) SOS onarımı

5) DNA çift zincir kırıklarının onarımı: Serbest uçların homolog olmayan bağlanması, homolog rekombinasyon (HR)


Genotoksisite


Genotoksisite; çekirdek, kromozom ve DNA yapısında meydana gelen DNA hasarlarını kapsar. Bu DNA hasarları; DNA eklentilerini, DNA kırıklarını, gen mutasyonlarını, kromozom anormalliklerini, klastojeniteyi ve anöploidiyi kapsamaktadır.


Somatik ve üreme hücrelerindeki genetik değişiklikler, düşük dozlarda bile ciddi sağlık sorunlarına neden olabilmektedir. Somatik hücrelerdeki mutasyonlar, protoonkogenez, tümör supresyon geni ve/veya DNA hasar yanıt geninde meydana geliyorsa kansere ve birçok genetik hastalığa yol açmaktadır. Ayrıca somatik hücrelerde oluşan DNA hasarı; yaşlanma, immün sorunlar, kardiyovasküler ve nörodejeneratif hastalıklarla da ilişkilendirilmektedir.


Üreme hücrelerinde meydana gelen mutasyonlar, spontan abortuslara, infertiliteye ya da yeni doğanda kalıtsal hasarlara yol açmaktadır.


Genotoksisite, genotoksik bir etki sonucunda meydana gelmektedir. Genotoksik etki ise; genotoksik maddelerin DNA’da hasar meydana getirmesi ya da baz değişimlerine neden olmasıdır. Genotoksik maddeler özellikle DNA ya da genomun kopyasının yapılmasında rol oynayan enzimlerle etkileşime girerek mutasyonlara neden olmaktadır.


Genotoksisite testlerinin sınıflandırılması



Genotoksisite testleri, direkt ya da etki mekanizması yolu ile indirekt olarak genetik hasarı indükleyen kimyasalların saptanması için kullanılmaktadır. Genotoksisite testlerinde belirlenen kimyasal bileşenler, insan karsinojen ya da mutajen veya kanser ve/veya genetik defektlere neden olabilen yapılardır.


Özellikle yeni ilaç geliştirme ve yeni ilaç onayı için gerekli olan ruhsatlandırma çalışmalarında yapılacak olan genotoksisite testleri önem kazanmaktadır. İlaç geliştirme çalışmalarının erken evresinde yapılacak olan genotoksisite çalışmaları ile ilaç piyasaya sürüldükten sonra ortaya çıkabilecek olumsuz sonuçların önüne geçilmektedir.


Yapılan genotoksisite testlerinin başlıca amaçları; mutajenlerin tanımlanması, insanda risk tayininin yapılması ve bu maddelere gereksiz maruziyetin önlenmesidir.


Genotoksisite testleri ile tespit edilebilen hasar tipleri şunlardır: Direkt DNA hasarı, gen mutasyonları, yapısal kromozom hasarları ve sayısal kromozom hasarları.


İn vitro genotoksisite testleri:


Birçok in vitro genotoksisite test metotları mevcuttur. En çok kullanılan yöntemler ise şunlardır:


- Bakteriyel revers mutasyon testi (AMES testi): Bakteri hücrelerindeki sonlanım noktalarında yer alan gen mutasyonlarını tespit eder.


- Memeli kromozom anomalili testi: Sonlanım noktasındaki kromozom anomalilerini saptar.


- Memeli hücresi gen mutasyon testi: Bir diğer adıyla fare lenfoma testidir. Gen mutasyonlarının saptanması için kullanılır.


İn vivo genotoksisite testleri:


Yapılan in vitro genotoksisite testleri pozitif sonuç verirse in vivo testler, in vitro testlere ek olarak uygulanmaktadır.


- İn vivo komet yöntemi: Potansiyel genotoksik ya da mutajenik kimyasalların risk değerlendirilmesinde çok sık kullanılan bir yöntemdir. DNA hasarının tespiti için kullanılır. Özellikle birçok test ile tespit edilemeyen primer DNA lezyonlarının saptanmasında bu yöntem oldukça önemlidir. Bu yöntem çeşitli dokulara ve hücre tiplerine uygulanabilmektedir. Düşük DNA hasarının saptanmasında oldukça hassas bir yöntemdir. Ayrıca bu yöntemin avantajlarından biri de kısa sürede testin sonuçlanabilmesidir.


- İn vivo mikronukleus testi/in vivo kromozom anomali testi: Kromozomlarda meydana gelen hasarın saptanması için kullanılır. Mutajen kimyasala maruz kalan hücre bölünme esnasında hasar görebilir ve ana çekirdek yapısına ek olarak daha küçük mikroçekirdek yapısı meydana gelebilir. Bu test yöntemi ile oluşan mikroçekirdek yapısı saptanmaktadır. Mikroçekirdek yapısının oluşması hücre hasarının göstergesidir.






Kaynakçalar

1-) Mohamed, S. A. K. S., Sabita, U., Rajendra, S., & Raman, D. (2017). Genotoxicity: mechanisms, testing guidelines and methods. Glob. J. Pharm. Pharm. Sci, 1, 1-6.

2-) Baydin, P. Ö. (2019). Micronucleus Based Genotoxicity Tests. Türkiye Klinikleri. Tip Bilimleri Dergisi, 39(1), 108-112.

3-) https://www.cyprotex.com/toxicology/genotoxicity

4-)https://ec.europa.eu/jrc/en/eurl/ecvam/alternative-methods-toxicity-testing/validated-test-methods/genotoxicity

5-) Üstündağ A.,(2019) Genotoksisite Testleri Slayt

6-) https://tr.wikipedia.org/wiki/DNA

312 görüntüleme

Türkiye'nin Tek Popüler Genetik Bilim Dergisi

Bezelye Dergi ISSN: 2587-0173

Bizi Takip Et
  • Beyaz Facebook Simge
  • Beyaz Instagram Simge
  • White Twitter Icon
  • Icon-gmail
  • kisspng-white-logo-brand-pattern-three-d
  • images
  • medium
  • Dergilik
  • YouTube

© 2019 by Bezelye Dergi