Hücre Ölümü Tespitinde Kullanılan Floresan Teknikler
Başak Toker - Moleküler Biyoloji ve Genetik, Temel Bilimler Fakültesi, Gebze Teknik Üniversitesi
Ökaryotik hücrelerde apoptoz, nekroz ve otofaji olmak üzere üç çeşit hücre ölümü vardır [1, 2]. Yapılan çalışmalara göre apoptoz, birçok hastalıkla bağlantılıdır. Hücrelerin normal apoptotik hücre ölümüne maruz kalmaması; kanser, otoimmün bozukluklar ve viral enfeksiyonlar gibi çeşitli hastalıkların patogenezine bağlanabilir [3, 4]. Apoptoz, gittikçe artan sayıda hastalıkta rol oynadığından, hücre ölümünü doğru bir şekilde tespit edebilecek yöntemlere sahip olmak oldukça önemlidir [2, 3, 5]. Hücre ölümünü tespit etmek için pek çok yöntem vardır. Bu yöntemler, DNA içeriğindeki değişiklikler, DNA parçalanması, zar bütünlüğünün değişmesi, hücre zarının asimetrisinin kaybı gibi farklı morfolojik veya biyokimyasal özelliklerine dayanmaktadır [2].
Hücre ölümünün tespiti için kullanılan floresan yöntemlerden sık kullanılan birkaçı şunlardır:
Floresan Mikroskobu
Floresan mikroskopi, floresan maddeler kullanılarak yapılan bir boyama yöntemidir. Floresan boyalar DNA'ya bağlanarak kromatini, dolayısıyla çekirdeği mikroskop altında görünür hale getirir. Bu boyalar hücre kültürü çalışmalarında kullanıldığında, canlı hücrenin cansız hücreden ayırt edilmesine yardımcı olurlar. Hangi hücrenin yaşadığını ve hangi hücrenin ölü olduğunu anlamak için, tüm canlı veya ölü hücreleri boyayabilen bir boya (örn. Hoechst boyası) ve sadece ölü hücreleri boyayabilen başka bir boya (örn. Propidyum iyodür) kullanılır. Zarları bozulmamış canlı hücreler, propidyum iyodür gibi sadece zar bütünlüğü bozulmuş (ölü) hücreleri boyayan bir maddeyle boyanmazken, tüm ölü veya canlı hücrelere girebilen Hoechst boyası ile boyanır. Bu yöntem kullanılarak hücrelerin ölü veya canlı olup olmadığı anlaşılabilir, ancak apoptoz veya nekroz arasındaki ayrım, hematoksilin boyamasında olduğu gibi çekirdek morfolojisine bakılarak yapılır. Kromatin yoğunlaşması veya çekirdek parçalanması olan hücreler, apoptotik hücreler olduklarını gösterir [6].
Floresan Boyama Teknikleri:
4 ’, 6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyama
Propidium iyodür boyama (PI)
Hoechst 33342 boyama
Hoechst 33342 ve DAPI veya PI çift boyama
Akridin turuncusu (AO) - etidyum bromür (EB)
ssDNA boyama
SYTO prob boyama
Akış Sitometrisi
Akış sitometrisi, tamponlu tuz bazlı bir çözelti içinde askıya alınmış haldeyken tekli hücreleri veya parçacıkları tekli veya çoklu lazerlerden geçerken hızlı bir şekilde analiz edebilen bir teknolojidir. Görünür ışık dağılımı ve bir veya birden fazla floresan parametresi için her parçacığı analiz eder. Görünür ışık dağılımı, hücrenin göreceli boyutunu gösterebilen ileri yön ve hücrenin iç karmaşıklığını veya tanecikliğini belirten 90 ° olmak üzere iki farklı yönde ölçülür. Işık dağılımı, floresandan bağımsızdır. Örnekler, floresan proteinlerin transfeksiyonu ve ekspresyonu yoluyla, floresan boyalarla boyama veya floresan olarak konjüge edilmiş antikorlarla boyama yoluyla floresan ölçümü için hazırlanır [8].
Akış sitometrisi, membran, sitoplazmik ve nükleer antijenlerin saptanmasına dayanan çeşitli uygulamalarda kullanılır. Ayrıca organeller, nükleik asitler, sitokinler, hormonlar ve protein içeriği gibi tam hücreler ve hücresel bileşenler de akış sitometrisi ile araştırılabilir. Akış sitometrisi için geliştirilen yöntemlerin yaygın olarak kullanılan örneklerinden bazıları hücre proliferasyonu ve hücre döngüsü, kalsiyum akışı ve membran potansiyeli ölçümleridir [9].
I. Annexin V Yöntemi
Normal hücrelerde, hücre zarının sitoplazmik yüzeyinde zar lipidlerinden biri olan fosfatidilserin (PS) bulunur. Hücre apoptoza girerse, normalde iç yüzeyde bulunan PS molekülleri, hücre zarının dış yüzeyine doğru yer değiştirir. Bu yer değiştirme, hücre zarı bütünlüğünün bozulmadığı apoptotik hücre ölümünün erken aşamalarında meydana gelir [6]. Bu deney, protein anneksin V'nin kalsiyum varlığında fosfatidilserin (PS) 'ye bağlanma kabiliyetine dayanmaktadır [2]. Anneksin V boyalı hücrelere propidyum iyodür (PI) ilavesi; canlı hücreler, erken apoptotik ve geç apoptotik ve nekrotik hücreler arasında ayrım yapılmasına izin verir [11].
II. TUNEL Yöntemi
TUNEL (TdT aracılı dUTP çentik uç etiketleme); eksojen terminal deoksinükleotidil transferazın (TdT), floresan etiketli dideoksinükleotitlerin (ddUTP'ler) DNA ipliği kırılmalarının açıkta kalan 3’-OH uçlarına bağlanmasını sağlama kapasitesine dayanan bir yöntemdir. Floresan yoğunluğu daha sonra akış sitometrisi ile değerlendirilir. Bir ddUTP molekülü her kırılmaya bağlanacağından yoğunluk, DNA ipliği kırılmalarının sayısı ile doğru orantılıdır [2].
III. Sub-G1 Fraksiyonu
Parçalanmış, düşük moleküler ağırlıklı DNA, sulu çözeltilerde hücre boyama işlemi sırasında, etanol veya metanol gibi çökeltici sabitleyicilerle işlenerek hücrelerden ekstrakte edilebilir. DNA ekstraksiyonunun bir sonucu olarak, apoptotik hücreler DNA içeriğinde bir eksiklik sergiler. DNA'ya özgü florokrom ile boyamanın ardından, akış sitometrisi tarafından fraksiyonel DNA içeriğine sahip hücreler olarak tanınabilirler. Frekans dağılım histogramlarında bu olaylar, oligonükleozomal DNA fragmanlarını temsil eden ayırt edici bir "sub-G1" zirvesi ile karakterize edilir [12]. Nekrotik hücreler, nükleer membran patlayana kadar normal bir hücre döngüsü profili gösterirler [2].
IV. FLICA Yöntemi
Normal fizyolojik koşullar altında kaspazlar, çok düşük iç aktiviteye sahip zimojenler olarak sitoplazmada yapısal olarak ifade edilir. Transkatalitik bölünme ve ardından dimerizasyon üzerine aktive olurlar. Spesifik olarak, bölünmüş moleküller baştan sona konfigürasyonda iki aktif enzimatik bölgeye sahip tek bir heterotetramer oluşturmak üzere bir araya gelir. Kaspazlar aktive edildikten sonra, kendi kendine çoğalmaya, hayati hücre substratlarının bölünmesine ve nihai hücre parçalanmasına yol açan, orkestre edilmiş bir proteolitik kademede işlev görür.
Florokrom etiketli kaspaz inhibitörleri (FLICA), apoptozu hem sitometri hem de floresan mikroskobu ile uygun şekilde belirlemeyi sağlar. FLICA'lar, bireysel kaspazların aktif merkezlerine afinite ligandları olarak tasarlanmışlardır. Her molekülün üç fonksiyonel alanı vardır: florokrom, dört amino asit peptidinden oluşan kaspaz tanıma elemanı ve kloro-or florometil keton (CMK) bağlayıcı kısım. Bireysel kaspazlara yönelik özgüllük, tanıma öğesi tarafından sağlanır. En yaygın FLICA kitleri, valil-alanil-aspartik asit dizisini (VAD) içermektedir. FLICA molekülünün kaspaz aktif merkezine kenetlenmesinden sonra, FMK aktif sistein ile reaksiyona girer ve bir tiyometil keton oluşturur. Bu geri döndürülemez kovalent reaksiyon hedef enzimi inaktive eder. Floresan etiketin (FITC veya SR) varlığı, hücreler içindeki FLICA-kaspaz komplekslerinin saptanmasını sağlar. FLICA'lar, hücre zarından oldukça rahat geçebilir ve nispeten toksik değildirler. Böylece, bu reaktiflerin hücreye alımını takiben, aktive edilmiş kaspazlara kovalent balanma gerçekleşerek canlı hücrelerde kaspaz aktivasyonunu saptamak için benzersiz bir fırsat sağlar [13].
V. Mitokondriyal transmembran potansiyelinin (Δψm) dağılması
Δψm kaybının sitometrik tespiti, erken apoptotik olayların hassas bir göstergesidir. Prosedürler, canlı hücreler tarafından kolayca alınan ve Nernst denklemine göre mitokondri içinde biriken lipofilik katyonik problara dayanmaktadır. Hücresel floresans yoğunluğu ile ölçüldüğü için alımlarının kapsamı Δψm durumuyla orantılıdır. Δψm-duyarlı probların çoğu, floresan etiketli kaspaz inhibitörleri (FLICA) tarafından kaspaz aktivasyonu, Annexin V tarafından fosfatidilserin (PS) maruziyeti ve propidyum iyodür (PI) veya YO-RO 1 ile plazma membran geçirgenliği dahil olmak üzere diğer apoptotik belirteçlerle çok parametreli tespit için kolayca uygulanabilir [13].
Referanslar
Cummings, B. S., & Schnellmann, R. G. (2004). Measurement of Cell Death in Mammalian Cells. Current Protocols in Pharmacology. doi:10.1002/0471141755.ph1208s25
Leite, M., Quinta-Costa, M., Leite, P. S., & Guimarães, J. E. (1999). Critical evaluation of techniques to detect and measure cell death--study in a model of UV radiation of the leukaemic cell line HL60. Analytical cellular pathology : the journal of the European Society for Analytical Cellular Pathology, 19(3-4), 139–151. https://doi.org/10.1155/1999/176515
Binet, J. L., Mentz, F., & Merle-Beral, H. (1996). Apoptosis in blood diseases Review - new data. Hematology and Cell Therapy, 38(3), 253–264. doi:10.1007/s00282-996-0253-z
Thompson C. B. (1995). Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science (New York, N.Y.), 267(5203), 1456–1462. https://doi.org/10.1126/science.7878464
Hickman J. A. (1996). Apoptosis and chemotherapy resistance. European journal of cancer (Oxford, England : 1990), 32A(6), 921–926. https://doi.org/10.1016/0959-8049(96)00080-9
Güleş, Ö , Eren, Ü . (2008). Apoptozun Belirlenmesinde Kullanılan Yöntemler . Yüzüncü Yıl Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi , 19 (2) , 73-78 . Retrieved from https://dergipark.org.tr/tr/pub/yyuvfd/issue/13739/166297
Atale, N., Gupta, S., Yadav, U. C. S., & Rani, V. (2014). Cell-death assessment by fluorescent and nonfluorescent cytosolic and nuclear staining techniques. Journal of Microscopy, 255(1), 7–19. doi:10.1111/jmi.12133
McKinnon K. M. (2018). Flow Cytometry: An Overview. Current protocols in immunology, 120, 5.1.1–5.1.11. https://doi.org/10.1002/cpim.40
Wlodkowic D, Skommer J, Akagi J, et al. (2013). Multiparameter analysis of apoptosis using lab-on-a-chip flow cytometry. Curr Protoc Cytom, 66, 9.42.1–.42.15.
Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., & Nalbant, A. (2016). Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews in Biotechnology, 37(2), 163–176. doi:10.3109/07388551.2015.1128876
Koopman, G., Reutelingsperger, C. P., Kuijten, G. A., Keehnen, R. M., Pals, S. T., & van Oers, M. H. (1994). Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood, 84(5), 1415–1420.
Wlodkowic, D., Skommer, J., & Darzynkiewicz, Z. (2009). Flow cytometry-based apoptosis detection. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 559, 19–32. https://doi.org/10.1007/978-1-60327-017-5_2
Wlodkowic, D., Telford, W., Skommer, J., & Darzynkiewicz, Z. (2011). Apoptosis and beyond: cytometry in studies of programmed cell death. Methods in cell biology, 103, 55–98. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-385493-3.00004-8