Işık Mikroskopisi
Güncelleme tarihi: 9 Nis 2021
Ayça İrgit - Moleküler Biyoloji ve Genetik, Fen - Edebiyat Fakültesi, İstanbul Teknik Üniversitesi
İnsanın görme sınırlarını esneten iki önemli icat vardır: teleskop ve mikroskop. Teleskop, insanların makro dünyayı yani yıldızları ve gök cisimlerini; mikroskop ise insanların mikro dünyayı yani mikroorganizmaları inceleme ve anlama çabasına ışık tutmuştur. Mikroskobun icadı ile birlikte yaşam bilimleri alanında önemli gelişmeler ve keşifler olmuş, mikro dünyanın gizemli yapısı aydınlatılmaya başlanmıştır. Canlıların moleküler düzeyde incelenmesine olanak veren mikroskopi teknikleri yaşam bilimlerinde bugünkü bilgi düzeyine ulaşmamızda büyük bir öneme sahiptir. Yaşamın temel birimi olan hücrelerin incelenmesi ve yapı taşlarının anlaşılması, canlı dokuların mikroskop altında incelenmesi sayesinde mümkün olmuştur. Mikroskobun icadı mikrobiyolojinin de başlangıç noktası olmuş, mikroorganizmalar tanınmaya, incelenmeye ve araştırılmaya başlanmıştır[1].
Işık Mikroskobu
İlk olarak kullanılan mikroskoplar ışık mikroskoplarıdır. Işık mikroskobunun çalışma prensibi, ışık kaynağından çıkan ışığın kondansatör (yoğunlaştırıcı) tarafından odaklanarak numuneden yansıması ve lenslerin odak noktasında kırılması ile retinada görüntü oluşmasına dayanmaktadır. Işığın ilk olarak objektif lenste ve ikinci kez oküler lenste kırılması ile numunenin büyütülmüş bir görüntüsü retinada oluşur[2].
En yaygın kullanılan objektif lens büyütme oranları 4X, 10X 40X ve 100X’tir. 100X büyütme oranına sahip objektif lens lam ile objektif arasına damlatılan immersiyon yağı (sedir yağı) ile birlikte kullanıldığından dolayı immersiyon objektifi olarak da adlandırılmaktadır. İmmersiyon yağı lensin ışık toplama kapasitesini arttırarak lensten geçen ışık miktarını artırmaktadır. Objektif lensin büyütme oranının artması numunenin görülen yüzey alanı azalmasına ve numunenin daha büyük ve detaylı incelenmesine olanak sağlar. Mikro boyuttaki hücrelerin incelendiği mikrobiyoloji çalışmalarında 100X büyütme oranına sahip objektif lensler kullanılmaktadır. Oküler lensin kullanılan en yaygın büyütme oranı 10X’tir[4].
Mikroskoplarda görüntüleme ile ilgili iki önemli kavram karşımıza çıkmaktadır: büyütme (magnification) ve çözünürlük (resolution). Büyütme, numunenin kaç kat büyütüldüğünün ölçüsüdür ve objektif lensin büyütme oranının ile oküler lensin büyütme oranının çarpımı ile mikroskobun büyütme değeri (magnification power) hesaplanır[4]. Çözünürlük ise ayırma gücü olarak tanımlanır ve mikroskopta ayrı noktaların görüntülerinin birbirinden ayrı olarak görülmesinin ölçüsüdür. Mikroskobun çözünürlüğü ışığın dalga boyuna bağlı olarak değişir[5].
Şekil2’de A ile ifade edilen ve n.sinα çarpımına eşit olan numerik apertür objektif lensin ışık toplama gücü olarak ifade edilmektedir. Numerik apertür ile lensin büyütme oranı arasında bir korelasyon bulunmakta, büyütme oranının yüksek olduğu lenslerde numerik apertür de artmaktadır[1]. Işığın dalga boyu ışık mikroskobunun çözünürlüğünü sınırlandırmaktadır. Işık mikroskobunun çözünürlük sınırı 0.2 µm‘dir. Aralığındaki uzaklığın 0.2 µm’den küçük olduğu cisimler mikroskopta ayrı birer cisim olarak görüntülenemeyecektir. Elektron mikroskoplarında ise çözünürlük sınırı 0.2 nm‘dir (0.2 nm x 1000 = 0.2 µm)[1]. Elektronların dalga boyunun ışıktan daha düşük olması, ışık mikroskoplarındaki çözünürlük sınırının elektron mikroskopları ile aşılabilmesine olanak vermiş, daha yüksek çözünürlükte mikroskobik incelemeler yapılabilmesine olanak sağlamıştır. Dalga boyunun getirdiği sınırlamaların aşılabilmesi daha yüksek çözünürlükte mikroskop görüntülerinin elde edilmesinin yolunu açabilme potansiyeline sahiptir[6].
Mikroskop ile görüntülemede önemli bir diğer kavram da kontrasttır. Mikroskobik görüntülerde numene ile arka plan arasında renk kontrasının olması numunenin çevresinden ayırt edilebilmesi için gereklidir. Görüntüdeki kontrası arttırmak için çeşitli organik boyama yöntemleri kullanılabilmektedir. Görüntünün kontrastını arttırmak için bazı mikroskop çeşitleri ve mikroskopi teknikleri de geliştirilmiştir[1].
Işık Mikroskobu Çeşitleri
Işık mikroskopları gözle görünür spektrumdaki ışığın kullanıldığı ve gözle görülemeyen spektrumdaki ışığın kullanıldığı mikroskoplar olarak temel iki sınıfa ayrılabilmektedir. Gözle görülen spektrumdaki ışığın kullanıldığı mikroskoplar ise ışığın kullanılan özelliğine ve mikroskopların çalışma prensibine göre çeşitlilik gösterebilmektedir. Mikroskoplarda görüntü numunenin ışığın yansıma, kırılma, transmisyon ve absorbsiyon, interferens, polarizasyon, difraksiyon ve floresansı indükleme özelliklerinde yararlanılarak elde edilir. Mikroskoplarda görüntünün oluşması için ışığın kırılma, yansıma, polarizasyon, difraksiyon, transmisyon ve absorbsiyon, interferens gibi farklı özelliklerinden yararlanılabilmektedir. Işığın farklı özelliklerinin kullanılması ile görüntü elde edilebilen farklı mikroskop çeşitleri bulunmaktadır[2].
Gözle görülen ışığın kullanıldığı mikroskop çeşitleri:
1. Aydınlık Alan Mikroskobu
En temel ışık mikroskobu olan aydınlık alan mikroskobunda ışık direk olarak numuneden geçer ve hücrelerin farklı bölümlerinin ışığı farklı oranlarda soğurmasına bağlı olarak kontrast bir görüntü elde edilir. Hücrelerin bazı özel bileşenleri ile tepkime veren boyama yöntemleri ile görüntünün kontrastı artırılabilmektedir. Boyama işlemi öncesinde numunenin sabitlenmesi için etil alkol gibi bazı sabitleyiciler kullanmak hücreleri öldürebileceği için boyama teknikleri canlı hücrelerin gözlemlenebilmesi için uygun değildir[2,5].
2. Karanlık Alan Mikroskobu
Karanlık alan mikroskobunun çalışma prensibi kondansatörün altına yerleştirilen opak cisim ile merkez ışınların numuneye ulaşmasının engellenerek sadece eğik açıyla gelen ışınların numuneye ulaşması ile görüntünün oluşmasına dayanmaktadır. Karanlık alan mikroskobunda karanlık bir zeminde parlak görüntüler elde edilmektedir. Karanlık alan mikroskobu hücre hareketinin incelendiği çalışmalarda ve boyanmamış örneklerin incelenmesinde tercih edilmektedir[2,5].
3. Faz-Kontrast Mikroskobu
Faz-kontrast mikroskobu ile elde edilen görüntülerde hücrenin farklı bölgelerindeki yoğunluk ve kalınlıkların farklı olmasına bağlı olarak ışığın farklı kırılma indisine sahip bölgelerinde kontrast görülmektedir. Faz-kontrast mikroskobu hücre içi yapıların ve boyanmamış canlı hücrelerin incelenmesinde tercih edilmektedir. Faz-kontrast mikroskobunun numunenin ya da arka planın parlak görünmesine bağlı olarak pozitif (karanlık) faz-kontrast mikroskobu ve negatif (aydınlık) faz-kontrast mikroskobu olmak üzere iki alt çeşidi bulunmaktadır[2,5].
4. İnterferans Mikroskobu
Çalışma prensibi numuneden geçen ve geçemeyen iki ışının varlığına dayanan interferans mikroskobunda faz-kontrast mikroskobunda olduğu gibi farklı bölgelerdeki yoğunluk farkına bağlı olarak farklı kırılma indislerinden dolayı kontrast bir görüntü elde edilmektedir. Diferansiyel interferans mikroskop (DIC) en yaygın kullanılan interferans mikroskop çeşitlerinden biridir[5].
5. Polarizasyon (Kutuplaştırma) Mikroskobu
Polarizasyon mikroskobunun çalışma prensibi yapıların çift kırılma özelliğine dayanmaktadır. Polarizasyon mikroskobunda hücrelerin polarize ışığa duyarlı olan bölümlerinin, belli düzende tekrarlayan yapıların bulunduğu bölgelerin, ışığı saptırması ile koyu renk üzerinde parlak yapıların görüldüğü kontrast görüntüler elde edilebilmektedir. Fibröz proteinlerin, kristal yapıların ve kemiklerin incelenmesinde polarizasyon mikroskoplar tercih edilmektedir[2,5].
6. Stereo Mikroskop
Işığın obje üstünden yansıtılması ile objektife gönderilmesi çalışma mekanizmasına dayanan stereo mikroskoplar ile üç boyutlu yüzey görüntüleri elde edilebilmektedir[5].
7. İnverted (Ters) Mikroskop
Klasik ışık mikroskobundan farklı olarak inverted mikroskopta ışık kaynağı üstte, oküler lensler tablanın üstünde bulunmaktadır. In vitro fertilizasyon (IVF), mikrobiyoloji çalışmaları ve hücre doku kültürlerinin incelenmesinde inverted mikroskoplar tercih edilmektedir[5].
Gözle görülemeyen ışığın kullanıldığı mikroskop çeşitleri:
1. Floresan Mikroskobu
Floresan mikroskoplar, floresan özellik gösteren maddeler ile boyanmış numunelerin ultraviyole ışık (UV) spektrumunda (360nm-400nm) incelendiği mikroskoplardır. Hücre bileşenlerinin moleküler düzeyde incelenmesinde, DNA ve RNA’nın hücre içinde belirlenmesinde, mikroskobik boyama yöntemleri ile görüntülenemeyen yapıların görüntülenmesinde, maddelerin hücre içi ve hücre dışı yoğunluklarının belirlenmesinde floresan mikroskobu kullanılmaktadır[2,5].
2. Konfokal Mikroskobu
Floresan mikroskobunun özel bir çeşidi olan konfokal mikroskobunda floresan boyalarla boyanmış numuneler üzerlerine düşünülen lazer ışınları ile incelenmektedir. Fakat canlı hücrelere zarar verebilecek yüksek enerji kullanımının gerekliliğinden dolayı konfokal mikroskobu canlı hücrelerin gözlenmesi için uygun değildir[2,5].
Referanslar
Madigan, M. T., Bender, K. S., Buckley, D. H., Sattley, W. M. & Stahl, D. A., (2019), The Microbial World, Brock Biology of Microorganisms (15. Baskı), s. 37-67
Karakoç Z., Ketani, M.A. & Ketani, S., (2016), Mikroskopların Çalışma Mekanizması ve Çeşitleri, Dicle Üniversitesi Veterinerlik Fakültesi Dergisi 1(1):1-6
Bayraktaroğlu, A. G., Prof. Dr., Işık Elektron Mikroskopisi ve Doku Hazırlama Tekniği, Erişim Adresi: https://acikders.ankara.edu.tr/pluginfile.php/119805/mod_resource/content/1/2.%20hafta%20%C4%B1%C5%9F%C4%B1k%20elektron%20mikroskopi%20AGB.pdf
T.C. MEB, (2011), Mikroskoplar, Biyomedikal Cihaz Teknolojileri, Erişim Adresi: https://staff.emu.edu.tr/hasanozcelikhan/tr/Documents/BMET304/Mikroskoplar.pdf
Arıkoğlu, H., Kaya, D. E., Köksoy, H., Göktürk, F. & Yılmaz, İ., (2015-2016), Tıbbi Biyoloji Laboratuvar Kılavuzu, Selçuk Üniversitesi Tıp Fakültesi, Erişim Adresi: https://webadmin.selcuk.edu.tr/BirimDosyalar/Dosyalar/tip/tibbibiyoloji.pdf
Puralı, N., Prof. Dr., (2018), Işık Mikroskobunun Asırlık Sınırının Ötesine Geçiş, Bilim ve Teknik, ss. 77-85