Kanonik Olmayan Sekonder DNA Yapıları

Şevval Özkaya - Moleküler Biyoloji ve Genetik, Fen Bilimleri Enstitüsü, Necmettin Erbakan Üniversitesi

DNA, kanonik Watson-Crick çift sarmalının ötesinde birçok yapı oluşturabilmektedir. Artık kanonik olmayan yapıların genomik DNA da bulunduğu bilinmektedir. Günümüzde çeşitli kanonik olmayan (B dışı) DNA yapılarına ilgi artmaktadır ve önemli biyolojik işlevlere sahip oldukları anlaşılmaktadır. Guanin (G) açısından zengin G-dörtlüleri (G-quadruplex) ve Sitozin (C) açısından zengin i-motifler, in vivo (canlıda) tespit edilen en iyi karakterize edilmiş kanonik olmayan DNA motifleridir [1]. Bu yapıların insan hücrelerindeki in vivo (canlıda) varlığı, onları yapıya özgü bir şekilde tanıyan antikor parçaları kullanarak son görselleştirmelerine kadar belirsiz kalmıştır [2]. Bu DNA yapılarını hedefleyen küçük moleküller bu nedenle işlevlerini araştırmak için araştırma araçları olarak faydalanılmaktadır ve ayrıca büyük terapötik potansiyele sahip olduğu düşünülmektedir [3]. Örneğin, en kapsamlı şekilde araştırılan kanonik olmayan DNA yapıları arasında yer alan G-dörtlüleri (G4'ler), Guanin açısından zengin dizilerden kaynaklanabilen dört iplikli sarmal bir yapıdır ve bu yapı telomeraz inhibisyonu, transkripsiyonel düzenleme ve replikasyonda önemli role sahiptir[4]. Bu yapılar, Guanin tetradlarının (G-dörtlüleri) yığılması ile oluşturuldukları telomerik DNA ve gen promotor bölgelerinin Guanin açısından zengin dizilerinde ortaya çıkmaktadır. G-dörtlülerinin küçük moleküllerle stabilizasyonu kanser terapötikleri için büyük potansiyele sahiptir. Ayrıca i-motif (i-DNA), promotor bölgelerinde gen ekspresyonunu kontrol etmek için moleküler bir anahtar olarak hareket etme potansiyeline sahiptir [5].

Şekil 1- Kanonik olmayan sekonder DNA yapıları [6].

i-motif Gehring ve arkadaşları tarafından d(TCCCCC) dizisinden oluşan dört zincirli intermoleküler bir yapı olarak tanımlanmıştır. 1993 yılında tanımlanan i-motif, sitozin bazı bakımından zengin DNA dizilerinde asidik koşullar altında hemiprotonize sitozin-sitozin (C-C+) baz çiftleri tarafından oluşturulan bir tetrapleks yapıdır. Yani asidik koşullarda stabilize olan bu motif, birbirine bağlanmış, sitozin-sitozin+ baz çiftleri ile bir antiparallel yönelimde bir arada tutulan iki paralel iplikli DNA dubleksinden oluşmaktadır [7]. Sitozin, nükleobazlar arasında en yüksek pKa (asitlik sabiti) değerine sahiptir. Asidik koşullar altında protonlanmış sitozin ile Watson-Crick olmayan bir baz çifti oluşturulur. Katlanmış i-motifleri genellikle ph yaklaşık 7’nin altında bulunurken, katlanmamış yapılar daha yüksek ph da görülmektedir. İ-motif yapısı, karşılık gelen G4 yapılarından daha az kararlıdır ve tipik olarak düşük ph da bile daha düşük sıcaklıklarda açılmaktadır [8].

İnsan hücrelerindeki son gözlemden bu yana, i-DNA olarak da adlandırılan i-motif yapısına olan ilgi giderek artmaktadır [9]. Bu yapı iki geniş oluğa ve iki dar oluğa sahiptir ve C-C+ düzlemi G4'teki G-dörtlüsünden daha küçüktür. Sitozin açısından zengin diziler in vitro (laboratuvar ortamında) olarak iç ve moleküller arası i-motiflere katlanabilmektedir [5]. i-motif hakkındaki bilgiler hala sınırlıdır. Kesişen yapının oluşumu için kimyasal ve yapısal gereklilikler hakkında araştırmalar yapılmış ve istikrarından sorumlu özellikleri analiz etmeye çalışılmıştır [10]. İlginç bir şekilde, i-motif yapılarının oluşumunun hücre döngüsüne bağlı olduğu tespit edilmiştir ve geç G1 fazında zirve yaparken, S fazında G4 oluşumunun maksimum olduğu görülmüştür. Bu durum ise, i-motif ve G-dörtlülerinin gen ekspresyonu ve transkripsiyonunun düzenlenmesinde farklı roller oynayabileceğini düşündürmektedir [11,12].

İnsan telomerik tekrar bölgesinde d(TAACCC)n gibi diziler, sitozin olmayan bazlar arasında ekstra etkileşimler oluşturabilir ve yapının stabilitesine daha fazla katkıda bulunur. Bu durumda, TAA ipliği kendi üzerine bir döngü halinde katlanabilir ve ana sitozin çekirdeğinin üzerine yığılmış bir A-T baz çifti oluşturabilir. Telomerik dizi, i-motif yapısının bir ucundaki iki adenin ve timinlerden biri arasında hidrojen bağlı bir ağ oluşturabilir. Bu ek baz çiftlerinin her biri yapının stabilitesini daha da arttırmaktadır [7]. Tetrahymena telomerinden iki farklı 5'E ve 3'E i-motif tetramerlerinin (AACCCC) kristal yapıları, ipliklerin 5 'uçlarında sitozin baz çiftlerine dik olarak oluşan yeni adenin kümelerini gösterir. Bu özellikler, kristallerin oluşturabildiği alışılmadık derecede yüksek pH da (pH 7.5) stabil bir yapıya sahip olduklarını göstermektedir [9,13].

Çoğu organizmada, sentromerler çok sayıda birbirinin ardı sıra dizili tekrarlanan DNA dizisi (DNA satellit) içermektedir. Sentromerik DNA dizileri türler arasında önemli ölçüde farklılık gösterir ve aynı organizmanın kromozomlarında da farklı olabilir. İnsanlarda, alfoid satellit adı verilen 171 baz çiftlik (bp) bir DNA, sentromerler boyunca sıralı bir şekilde tekrarlanır. Alfoid satellit, dizisi CENP-B kutusu ve A kutusu olarak bilinen iki varyanta sahip 17 bp GC zengin bir segment içeren Adenin-Timin açısından zengin bir dizidir. Gallego ve arkadaşları, CENP-B kutusunun Guanin açısından zengin dizisinin kanonik baz çiftleri tarafından stabilize edilmiş bir yapıya katlanırken, tamamlayıcı Sitozin açısından zengin dizisinin asidik pH'da dimerik bir i-motif oluşturduğunu bulmuştur [14,15].

Şekil 2- İnsan sentromerik alfoid satellit DNA yapısı (A) ve i-motif (B) [7].

Hesaplamalı çalışmalar sonucunda, varsayılan G-dörtlüsü oluşturma dizilerinin tüm gen promotorlarının %43'ünde ve onkojen promotorlarının %69'unda bulunabileceği ortaya çıkarılmıştır. Henüz i-motifleri oluşturabilecek dizileri bulmak için genomun sistematik bir analizi yapılmamıştır [13]. Fakat bir dizi yerli i-motif oluşturma dizisi tanımlanmış ve karakterize edilmiştir [7]. Örneğin in vitro, c-MYC i-motifinin sadece pH 6.5'e kadar stabil olduğu bulunmuştur [16]. G-dörtlüleri ve i-motif yapılarının transkripsiyonel düzenlemedeki rolü artık bilinektedir. Çeşitli genlerin promotor bölgeleri içinde transkripsiyon başlama bölgesi (TSS)’nin yakınında bu yapıları oluşturabilen diziler bulunmaktadır. Proto-onkogenlerin G-dörtlü motiflerinden oluştuğu gösterilmiştir. c-MYC proto-onkogen promotoru, VEGF (Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü), c-kit (CD117), c-myb, PDGF-A (Trombosit türevi büyüme faktörü alt birimi A), KRAS, bcl-2 (B hücre lenfoma 2), hTERT (telomeraz revers transkriptaz), RET ve Rb promotor bölgeleri için de G-dörtlüsü motifi tanımlanmıştır. Sitozin bakımından zengin promotor bölgelerinin de i-motif yapıları oluşturduğu gösterilmiştir [16,17].

Tablo 1- İ-motif sekans örnekleri [7].

Referanslar:

1. B. Chu, D. Zhang, P.J. Paukstelis. (2019). A DNA G-quadruplex/i-motif hybrid, Nucleic Acids Research. 47 ,11921–11930.

2. H.A. Assi, M. Garavís, C. González, M.J. Damha. (2018). I-motif DNA: Structural features and significance to cell biology, Nucleic Acids Research. 46 ,8038–8056.

3. A. Ali, S. Bhattacharya. (2014). DNA binders in clinical trials and chemotherapy, Bioorganic & Medicinal Chemistry. 22, 4506–4521.

4. Spiegel, J., Adhikari, S., & Balasubramanian, S. (2020). The structure and function of DNA G-quadruplexes. Trends in Chemistry, 2(2), 123-136.

5. Y. Kanoh, S. Matsumoto, R. Fukatsu, N. Kakusho, N. Kono, C. Renard-Guillet, K. Masuda, K. Iida, K. Nagasawa, K. Shirahige, H. Masai. (2015). Rif1 binds to G quadruplexes and suppresses replication over long distances, Nature Structural & Molecular Biology 2015 22:11. 22, 889–897.

6. A. di Porzio, U. Galli, J. Amato, P. Zizza, S. Iachettini, N. Iaccarino, S. Marzano, F. Santoro, D. Brancaccio, A. Carotenuto, S. de Tito, A. Biroccio, B. Pagano, G.C. Tron, A. Randazzo. (2021). Synthesis and characterization of bis-triazolyl-pyridine derivatives as noncanonical dna-interacting compounds, International Journal of Molecular Sciences. 22.

7. H.A. Day, P. Pavlou, Z.A.E. Waller. (2014). I-Motif DNA: Structure, stability and targeting with ligands, Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22, 4407–4418.

8. I. Serrano-Chacón, B. Mir, N. Escaja, C. González. (2021). Structure of i-Motif/Duplex Junctions at Neutral pH, Journal of the American Chemical Society. 143 , 12919–12923.

9. Zeraati, M., Langley, D. B., Schofield, P., Moye, A. L., Rouet, R., Hughes, W. E., ... & Christ, D. (2018). I-motif DNA structures are formed in the nuclei of human cells. Nature chemistry, 10(6), 631-637.

10. Guéron Maurice, Leroy Jean-Louis. (2000). The i-motif in nucleic acids, Current opinion in structural biology. 10 , 326–331.

11. M. Zeraati, D.B. Langley, P. Schofield, A.L. Moye, R. Rouet, W.E. Hughes, T.M. Bryan, M.E. Dinger, D. Christ. (2018). I-motif DNA structures are formed in the nuclei of human cells, Nature Chemistry. 10, 631–637.

12. G. Biffi, D. Tannahill, J. McCafferty, S. Balasubramanian. (2013). Quantitative visualization of DNA G-quadruplex structures in human cells, Nature Chemistry. 5, 182–186.

13. H.A. Day, P. Pavlou, Z.A.E. Waller. (2014). I-Motif DNA: Structure, stability and targeting with ligands, Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22, 4407–4418.

14. J. Gallego, S.H. Chou, B.R. Reid. (1997). Centromeric pyrimidine strands fold into an intercalated motif by forming a double hairpin with a novel T:G:G:T tetrad: solution structure of the d(TCCCGTTTCCA) dimer., Journal of Molecular Biology. 273, 840–856.

15. J. Gallego, E.B. Golden, D.E. Stanley, B.R. Reid. (1999).The folding of centromeric DNA strands into intercalated structures: a physicochemical and computational study, Journal of molecular biology. 285, 1039–1052.

16. T.A. Brooks, S. Kendrick, L. Hurley. (2010). Making sense of G-quadruplex and i-motif functions in oncogene promoters, FEBS Journal. 277,3459–3469.

17. A. Tuâ N Phan, V. Kuryavyi, K.N. Luu, D.J. Patel. (2007). Structure of two intramolecular G-quadruplexes formed by natural human telomere sequences in K + solution, Nucleic Acids Research. 35, 6517–6525.