Kromatografi Yöntemleri ve Uygulamaları


Menşura Feray ÇOŞAR - Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, Fen Edebiyat Fakültesi, İstanbul Teknik Üniversitesi

Var olan karışımın içerdiği bileşenlerini, bu bileşenlerin birden fazla adım arası geçişlerini, niceliklerini belirlemek amacıyla yapılan; temeli ayırma özelliğine dayanan analitik metodlar “kromatografi” olarak adlandırılmaktadır. Kromatografi sırasında bileşenler ya iki sıvı evre arasında geçişlerine göre değerlendirilir ya da hareketlendirilen bileşenler daha durağan bir etmen üzerinde yüzeyde tutulmasına göre ayırt edilebilir. Durağan etmen ve bileşenler arasındaki etkileşim, kurulan bağların çeşitliliğine göre farklılık gösterebilmektedir[1]. Ayrıştırılmak istenen karışımın absorbans ya da sabit faz olarak adlandırılan gözenekli bir ortamda,karışım bileşenlerinin hareketli faz içerisindeki farklı davranışları sonucu birbirinden ayrılması olgusuna dayanan kromatografi yöntemlerinde; hareketli faz içindeki farklılık , kurulan hidrojen,Van der Waals bağları; dipol-dipol ve indüklenmiş dipol-dipol etkileşimleri sayesinde gerçekleşebilir[1].


Sabit fazda yer alan moleküllerin katı bir yüzeye yapışması ve tek tabaka halini alması ile oluşan absorpsiyon kromatografi yöntemleri sıvı-katı ve gaz-katı ayrıştırılması olarak sınıflandırılabilir. Sıvı-katı ayrıştırılmasında kullanılan ince tabaka kromatografisinde¸kullanılan sabit faz farklı boyutlardaki plakalar üzerine sıvanan silika ve selüloz gibi absorbans maddelerdir. Bu yöntemde hareketli faz, sabit faz üzerinden aşağıdan yukarı doğru ilerler. Hareketli faz, kılcallık etkisi ile plaka üzerinde yürütülür. Bu ilerleme plakanın alt kesimlerindeki karışımın içindeki malzemelerin farklı hızlarla yukarıya sürüklenme şeklinde gerçekleşmektedir[2].

Şekil 1: ince tabaka kromatografisi sonucu ayrıştırıaln karışım bileşenlerini temsil etmektedir[3].

Gaz-katı ayrıştırılmasında kullanılan gaz kromatografisinde genellikle helyum gibi belirli şartlar altında kimyasal reaksiyona girmeyen bir gaz veya azot gibi reaktif olmayan bir taşıyıcı gaz hareketli fazı oluştururken; katı destek üzerinde sıvı veya polimer bir mikroskopik tabaka sabit fazı oluşturmaktadır. Sabit faz ile kaplı olan kolon duvarları ile etkileşime giren gaz bileşikleri farklı zamanlarda bileşikler tarafından tutulurlar. Bu tutma süreleri karşılaştırılarak ayrım gerçekleştirilmektedir. Gaz kromatografisi kimyasal maddelerin ayrımı, teşhisi ve gözlenmesi yararlarından dolayı gıda ve aroma sanayide üretimi düzenleme açısından çok önemli bir konumdadır. Potansiyel zehir niteliğindeki sülfit aynı zamanda taze sebze ve meyvelerde koruyucu olarak kullanılmaktadır ve gaz kromatografisi sayesinde ayırt edilebilmektedir[4].

Şekil 2: gaz kromatografi mekanizmasını şematik olarak özetlemektedir[5].

İyon değiştirme kromatografisi; karışımın elektrik yüküne bağlı olarak ayrılması sağlayan bir tekniktir. Katı maddede bulunan iyonlarla, çözeltide bulunan aynı yüklü iyonların değiştirilmesi prensibine dayanan yöntemde selüloz, agaroz, dietilaminoetil (DEAE) ve karboksimetil (CM) gibi katılar en çok kullanılan sabit fazlardır. Absorblanmış örnekler pH değişimi veya iyon şiddeti artırılarak kolondan ayrıştırılabilmektedir. İyon değiştirici kromatografiler genellikle farklı karakterdeki aminoasitlerin ayrıştırılması aşamasında kullanılabilir. Örneğin lizin, arjinin ve histidin amino asitleri pozitif yüklü iken aspartik asit ve glutamik asit negative yüklü aminoasitlerdir. Proteinler de bu metod sayesinde farklı karakterdeki aminoasitlerin zıt yüklü yüzeylerle etkileşimi prensibine dayalı olarak ayrıştırılabilmektedir[6].

Şekil 3: iyon değiştirici kromatografilerin mekanizmasını temsil etmektedir[7].

Yüksek performanslı sıvı kromatografisi, geleneksel kromatografilerde kullanılan yerçekimi basıncının aksine yüksek basınçlı pompalar aracılığıyla faz iletimine dayanır. Daha sonrasında faz aracılığıyla taşınan ve katı bir absorbent maddeyle dolu kromatografik kolona ulaşan içerik, kolon ile farkli biçimlerde etkileşip, farklı sürelerde detektöre ulaşır. Kolonun kaplı olduğu absorbent madde sayesinde kromatografik ayrışma gerçekleştirilmiş olur. Absorbent madde genellikle granüler halde, silikon veya polimerik yapıdaki bir maddedir. Bu kromatografi yöntemi; idrar tahlili ile doping veya uyuşturucu madde tespiti, kompleks biyolojik örneklerin- sentetik maddelerin ayrıştırlması, kandaki D vitamini tespiti gibi pek çok alanda kullanılmaktadır[8].

Şekil 4: yüksek performanslı sıvı kromatografisinin çalışmasını temsil etmektedir [9].

Boya içerisinde bulunan kağıt, kumaş gibi malzemelerin boyayı emme özelliklerinden yola çıkılarak keşfedilen kılcal analiz hareketi; kromatografilerin geliştirilmesi için ilk adım olmuştur. Kromatografi ayrıştırma stratejisi sabit faza daha sıkı tutunan moleküllerin sabit fazda daha uzun süre kalması/yavaş hareket etmesi, diğer bir yandan sabit faza güçlü bir şekilde tutunamayan moleküllerin diğer bileşenlerden ayrılarak daha hızlı hareket etmesi üzerine kuruludur. Sabit fazda tutunma derecesi bileşenin faz ile etkileşim gücüne bağlı olup hareketli fazda görülen hızın etkisi bileşenin hareketli fazda çözünme oranına bağlıdır[10]. Günümüzde kromatografiler; adli tıptan, gıda kontrolüne kadar pek çok alanda tespit edilmek istenen bileşenlerin bulundukları ortamdan ayırt edilmesini sağlayan bir analitik kimya metodu olarak sıkça başvurulan bir yöntemdir.





Referanslar

  1. Miller, J. (2009). Chromatography. Digital Encyclopedia Of Applied Physics, 1055-1102. doi: 10.1002/3527600434.eap064.pub2

  2. Mabry T.J., Markham K.R., Thomas M.B. (1970) The Separation of Flavonoids by Column and Thin Layer Chromatography. In: The Systematic Identification of Flavonoids. Springer, Berlin, Heidelberg. https://doi.org/10.1007/978-3-642-88458-0_2

  3. Dawan, P., Satarpai, T., Tuchinda, P., Shiowatana, J., & Siripinyanond, A. (2017). A simple analytical platform based on thin-layer chromatography coupled with paper-based analytical device for determination of total capsaicinoids in chilli samples. Talanta, 162, 460-465. doi: 10.1016/j.talanta.2016.10.077

  4. Fothergill W. T. (1968). Gas chromatography. Technique. Proceedings of the Royal Society of Medicine, 61(5), 525–528.

  5. Skoog, D., Crouch, S., & Holler, F. (2007). Principles of instrumental analysis. Belmont, CA: Brooks/Cole, Cengage Learning.

  6. Jungbauer, A., & Hahn, R. (2009). Chapter 22 Ion-Exchange Chromatography. Methods In Enzymology, 349-371. doi: 10.1016/s0076-6879(09)63022-6

  7. Shen, C. (2019). Quantification and Analysis of Proteins. Diagnostic Molecular Biology, 187-214. doi: 10.1016/b978-0-12-802823-0.00008-0

  8. Bird I. M. (1989). High performance liquid chromatography: principles and clinical applications. BMJ (Clinical research ed.), 299(6702), 783–787. https://doi.org/10.1136/bmj.299.6702.783

  9. Akash M.S.H., Rehman K. (2020) High Performance Liquid Chromatography. In: Essentials of Pharmaceutical Analysis. Springer, Singapore. https://doi.org/10.1007/978-981-15-1547-7_14

  10. Hibbert, D. (2012). Experimental design in chromatography: A tutorial review. Journal Of Chromatography B, 910, 2-13. doi: 10.1016/j.jchromb.2012.01.020

70 görüntüleme0 yorum

Son Paylaşımlar

Hepsini Gör