Kromozom Boyama Tekniği (FISH)
Yaşar Yurtsever – İstanbul Teknik Üniversitesi
Fluorescence in situ Hybridization yani FISH, DNA veya çeşitli RNA tiplerinin (mRNA, non-coding RNA (lnc-RNA), microRNA (miRNA)) floresan boyalar ile boyanması tekniklerini içeren genel bir yöntemin ismidir. Başlamadan önce “prob” kavramına açıklık getirmemiz gerekir. Biyolojide bir prob, ilgilenilen bir nükleotit dizisine tamamlayıcı olan tek bir DNA veya RNA dizisine verilen addır. Problar hücresel ve hücresel olmayan olarak ikiye ayrılır. FISH teknikleri içerisinde genellikle hücresel Problar kullanılır. FISH yüksek derecede bir dizi tamamlayıcılığa sahip bir nükleik asit dizisinin belirli bir kısmına bağlanan floresan problarını içerir. Probların bir kromozomda nereye bağlandığını görmek için floresan mikroskopu kullanılır.
FISH yöntemi, 1980’lerin başında biyomedikal araştırmacıları tarafından kromozomlarda spesifik DNA dizilerinin olup olmadığını araştırmak ve var ise tespit etmek ve yerlerini belirlemek için kullanılmıştı. Daha sonra “İnsan Genom Projesi” sırasında DNA, RNA ve genomları incelerken sıklıkla kullanıldı. Bunun yanında çeşitli ilaç geliştirme aşamalarında, kanser ve tümör araştırmalarında kullanılmakta ancak yüksek maliyet ve zaman harcanması sebebiyle her araştırma için kullanılamamaktadır.
FISH günümüzde klinik çalışmalarda sıkça kullanılmaktadır. Eğer hasta şüpheli bir patojen tarafından enfekte olmuşsa hastanın dokusunda bu patojenin büyümesi veya davranışları incelenebilir. Çünkü genellikle en iyi bilinen bakteriler bile laboratuvar ortamında etkin bir büyüme ve gelişme gösteremez. FISH sayesinde direkt olarak canlı içinde incelenebilirler. Bunun yanında farklı iki türün genom benzerliklerinin karşılaştırılması için, kanser ve tümör hücrelerini incelemek, bulunan bir ilacın nasıl ve ne şekilde canlıyı etkilediğini görebilmek için kullanılmaktadır.
Genellikle DNA’da belirli bir özellik ya da lokasyonu ararken, hücrelerin üreme döngülerini incelerken, özellikle interfaz evresinde bir anormallik olup olmadığını incelerken (sayısal ve yapısal kromozomal değişiklikler, mutasyonlar, Anöploidi ve Trizomi gibi anormal durumlar), kanser ve tümör sebeplerini araştırırken kullanılmaktadır.
Problar sıklıkla DNA parçalarından elde edilir. İzolasyon, saflaştırma ve kuluçka işlemlerinden geçer. Ayrıca probların boyu da çok önemlidir, çünkü uzun probların hibridizasyonu kısa olanlara göre daha az spesifik olur. Bu nedenle kısa ipliklerden (genellikle 15-20 nükleotit) oluşturulurlar. Analiz sırasında bu parçalardan her birinin kopyası endonükleazlar ile daha küçük parçalara ayrılır ve bu küçük parçaların boyutunu ölçmek için de “boyut dışlama kramotografisi” adı verilen bir yöntem kullanılır.
Bu parçaların korunması için sürekli çoğalan bir bakteri popülasyonu sistemi oluşturulmuştur. Klon bakteri popülasyonu, tek bir yapay kromozomu koruyacak şekilde oluşturulur ve dünyanın birçok yerinde çeşitli laboratuarlarda depolanır. Bakteri Yapay Kromozomları (BAC) büyütülür, özütlenir ve etiketlenerek kütüphaneye kaydedilir. İlave bilgi olarak bu kütüphanelerde isimler verilirken genelde enstitünün adı verilir. Örneğin RPCI-11 kütüphanesi “Roswell Park Cancer Institude”nin kısaltmasıdır. Bu kütüphanelerde saklanan parçalar (fragments) 100.000 baz civarındadır ve çoğu FISH probunun temelidir.
RNA Hazırlanma ve Hibridizasyon Süreci
· Dondurulmuş dokular veya hücreler sabitlenerek daha geçirgen bir hale getirilir.
· 20 oligonükleotid çiftinden oluşan hedefe özgü dizayn edilmiş bir prob hedef RNA’ya hibritlenir.
· Uyumlu sinyal yükseltme işlemleri sonucu floresan mikroskobu altında gözlenebilirler.
DNA Hazırlanma ve Hibridizasyon Süreci
· Prob hazırlandıktan sonra hibridizasyon için boyutlarına bakılır, probun hedefine uygun büyüklükte olması gerekir.
· Problar florofor ile etiketlenir. (Genellikle antikor veya biotin (Vitamin H ya da B7 olarak adlandırılır.) kullanılır.)
· Metafaz ya da interfaz da bekletilen kromozomlar substrata eklenir.
· Örneğe kısa DNA parçaları ilave edilerek DNA’nın eşlenmesi bloke edilir.
· Problar bu aşamadan sonra kromozoma eklenir.
· Yaklaşık 12 saat boyunca DNA kuluçkaya yatırılır (incubation).
· Çeşitli yıkama aşamalarından geçirilerek hibridize olmayan ya da kısmi olabilen problardan arındırılır.
· Sinyal ayarları yapıldıktan sonra mikroskop altında görülebilir.
Prob ve Analiz Çeşitleri
Problar belirli renklere hedeflenebileceği gibi karıştırılarak daha farklı spektrumlarda renkler oluşturabilirler. Karışımdaki renklerin çeşitli olması daha derin incelemeler ve karakteristik renkler oluşturulmasına katkıda bulunur. Bunun yanında probların oluşturduğu karışımlar özelliklerini ve bağlanma yerlerini de etkiler. Bütün bir kromozom boyunca hibritlenen Problar gen sayılarını saymak, yer değiştirmelerini gözlemlemek veya ekstra kromozom parçalarını tanımlamak için kullanılır, bu işlem genellikle “bütün-kromozom boyama” denir. Yani özet olarak, mümkün olan her prob kombinasyonu kullanılsa idi hücrenin işimize yaramayan kısımları da boyanacaktı ve odaklanmayı zorlaştıracaktı, genellikle küçük Problar karıştırılarak özel lokus bölgelerini belirli renklerde işaretleyip daha net incelemeler yapılabiliyor. Özel lokus probları kromozomların sentromer bölgelerine bağlanarak kromozomların sayılmalarında da kullanılabiliyor.
Q – FISH
FISH problarını PNA’lar (Peptide Nucleic Acid) ile birleştirerek yapılır ve bilgisayar yazılımları aracılığıyla incelenir. Genellikle telomer uzunluğu araştırmalarında kullanılır.
Flow – FISH
Hücre popülasyonlarının DNA’sındaki tekrar eden elementlerin kopya sayılarını akış sitometrisi kullanarak ölçerler.
MA – FISH
Mikro akışkan destekli FISH, FISH problarının hedef DNA şeritleri ile hibridizasyonunu kare dalga salınımlı dalgalar uygulanarak elde edilir ve kısa sürede sonuca ulaşılabilir.
HF – FISH
Hybrid Fusion FISH, dinamik optik iletim (DOT) olarak bilinen bir etiketleme işlemi yoluyla ek spektrumlar üretmek için kullanılır.
Kaynakçalar
Bernasconi, B., Karamitopolou-Diamantiis, E., Tornillo, L., Lugli, A., Di Vizio, D., Dirnhofer, S., Wengmann, S., Glatz-Krieger, K.; Fend, F., Capella, C., Insabato, L., Terracciano, L. M. (2008). "Chromosomal instability in gastric mucosa-associated lymphoid tissue lymphomas: A fluorescent in situ hybridization study using a tissue microarray approach". Doi:10.1016/j.humpath.2007.08.009.
Nguyen H. T., Trouillon R., Matsuoka S., Microfluidics-assisted fluorescence in situ hybridization for advantageous human epidermal growth factor receptor 2 assessment in breast cancer. Laboratory Investigation (2017) 97, 93–103; doi:10.1038/labinvest.2016.121; published online 28 November 2016
What is the Hybrid Fusion FISH, http://www.prevnos.com/hybrid-fusion-fish
Ried T., Schröck E., Ning Y., Wienberg J., Chromosome painting: a useful art, National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health, Building 49, Room 4A28, 49 Convent Drive, Bethesda, MD 20892-4470, USA and 1Department of Pathology, Cambridge University, Cambridge, UK ,1998 Oxford University Pres, (May 18, 1998)
Carter N. P., Cytogenetic Analysis by Chromosome Painting, Department of Pathology, University of Cambridge, Cambridge, United Kingdom, Cytornetry (Communications in Clinical Cytometry) 18:2-10 (1994). DOİ: 10.1002/cyto.990180103
Marcus A., Human Genetics An Overview, Alpha Science International Ltd, section 7.6