Metabolomiks ve MATDI-TOF Tekniği
Zeynep Salgın – Biyoloji, Yüksek Lisans, Fen Bilimleri Enstitüsü, Aydın Adnan Menderes Üniversitesi
Metabolom kavramı , bir organizmada üretimi gerçekleştirilen bütün metabolik ara ürünleri ve diğer küçük olan molekülleri de içerisine dahil eden bir kavramdır. Metabolomiks, küçük olan metabolitlerin çok fazla çeşitliliği sebebiyle diğer ‘’omik’’ lere nazaran geride kalmıştır. Bu durum ise sistematik şekilde tarama yapılmasını da zorlaştırarak teknik açıdan araştırmaları da zorlaştırmaktadır[1]. Bu konu hakkında ilk denemeler ise 13C- glikoz ( 13C, glukoz çoğunluğu, 12C olan ise karbonun ağır bir izotopudur) ile işaretlenerek hücre özütlerinin, nükleer manytik rezonansı (NMR) ile analiz edilmesiyle başlanmıştır. Ancak bu yöntemde görülen en belirgin özellik hassasiyeti sınırlıdır ve bu yöntemle bir karışımı eş zamanlı olarak tanımlayabilme işlemindeki bileşen sayısı, hücre özütlerinin çözümlenebilme için son derece az bir sonuç vermektedir[2].
Metabolomiks için en umut veren yöntem yaklaşımlarından birisi de yeni ve farklı bir şekilde dizayn edilen kütle spekrometrisi tekniklerinin geliştirilmesi ve kullanılmasıdır. Bu yaklaşımların belirli bir sınıf moleküller ile sınırlı olmayıp son derece yüksek seviyede hassas olabilmektedir. 12C’nin kütlesi tam manasıyla 12 moleküler birim (Dalton) olarak tanımlanmıştır. Ancak 14N yahut 16O gibi diğer atom kütleleri ise tam bir sayıyı ifade etmeyip küsüratlı sayı ölçümlerine sahiptirler[3].
Yüksek seviyede kütle çözünürlüğü kullanılan kütle spektrometrisi, herhangi bir küçük molekül biriminin moleküler birimini ya da formülünü kesin bir biçimde verebilmektedir. Bariz bir biçimde yine izomerler de aynı formüle sahip olacaklardır fakat kütle spektrometrisi işlemi esnasında farklı bölünmeler gerçekleştirerek tanınabilmektedirler. Yine bu yaklaşım şekli kullanılarak proteom analizi esnasında, parçalanmış proteinlerden elde edilen peptit parçalarını da tanımlarken de kullanılabilmektedir. Bu durumda karşımıza çıkan sonuçlardan biri ise birkaç oligopeptidin tanımlanması da amino asit dizisi bilinmek suretiyle ana proteinin kimliğinin çıkartılmasına olanak sağlamaktadır[4].
Şekil 1: (MALDI-TOF), Matriks destekli lazer emilimi iyonizasyonu[12].
Kütle spektrometrisinin MALDI tipi versiyonunda örnek bir lazer yardımıyla iyonize edilerek buharlaştırma işlemi gerçekleştirilir. Bu süreç içerisinde oluşan iyonlar kolon yardımıyla dedektöre doğru hareket eder ve elektrik alanıyla ivmelendirilir. Her iyonun uçuş süresi (TOF) ise her bir iyonun kütle/yük oranına bağlıdır ve bu iyon yükü oranı ne kadar küçük ise iyon da o kadar hızlı hareket etmektedir. Dedektör ise her bir iyon için TOF’u hesaplar ve bilgisayar var olan kütleyi ve de dolayısıyla moleküler formülü göstermektedir. Bu iki tekniğin hibrit şekilde birleştirilip kombinasyon oluşturmasına da MALDI-TOF adı verilmektedir[5-6].
Metabolom analizleri özellikle bitki niyokimyası açısından son derece öenm arz etmektedir ve bitkiler birkaç bin farklı metabolit üretimi gerçekleştirme yeteneklerine sahiptirler, bu özellik de diğer tüm organizmaların metabolik molekül üretiminin pek çoğundan daha fazla miktar demektir. Bu üretilen metabolitler içerisinde sekonder metabolit diye adlandırılan ikincil metabolitler ise ticari olarak kullanılan, kokuları, aromaları, alkoloidleri ve pigmentleri oluşturmaktadır. Metabolomik araştırmalar öncelikle Arabidopsis diye adlandırılan model bitki örneği ile başlamış ve başlangıç olarak bu teknik kullanılıp birkaç yüz metabolitin seviyeleri ölçülmüştür. Bu süreçte ise söz konusu metabolitlerin seviyelerinde sıcaklık değişimlerine tepkisel olarak değişimler de gözlenmiştir[7]. Metabolomiksdeki sonraki araştırma süreçleri içerisinde ise hastalıkların çeşitli insan organları ve dokularının metabolomu üzerindeki etkilerinin incelenme aşamaları takip etmektedir. Bu tür sonuçlar ise insan vücudunun bulaşıcı yahut bulaşıcı olmayan hastalıklarla nasıl tedavi edilmesi yahut başa çıkılabilmesi iaçısından bizlere örnek teşkil edip bu tedavi süreçlerindeki savunmasal etkileri ile ilişkili anahtar bileşenleri tanımamızı ve belirlememizi de sağlamaktadır. Sözü geçen bileşenler ise kuvvetle muhtemel olarak belirli tür hastalıkların tedavisi için de ilaç şeklinde geliştirilmesi ön görülmektedir[8].
MALDI teknolojisinin temelinde 3 aşama bulunmaktadır. Öncelikli olarak numune uygun bir matris özellikteki malzeme ile karıştırılır ve metal bir plakaya uygulaması gerçekleşir. Bir sonraki aşamada darbeli bir lazer numuneyi ışınlayarak numunenin ve bununla beraber matris malzemesinin ablasyonunu ve desorpsiyonunu tetiklemektedir. Son olarak da analit moleküller ablatılmış gaz molekülleri ile sıcak bulut içerisinde protonlanarak yahutta protonsuzlaştırılarak iyonize edilmektedir ve son işlem olarak bunları analiz etmek için kullanılan kütle spektrometrisinde hızlandırılma işlemi uygulanır[9].
Matris Destekli Lazer Desorpsiyon İyonizasyonu- MALDI
MALDI terimi ilk olarak 1985 yılında bir grup bilim insanı ( Franz Hillenkamp, Michael Karas ve arkadaşları) tarafından icat edilmiş ve alanin amino asitini triptofan aminoasiti ile karıştırmışlar, 266 nm’lik lazer ışığında daha kolay işlem gördüğünü ve iyonize edilebileceğini keşfetmişlerdir. Triptofan amino asidinin lazer enerjisi emmekle birlikte ve emici olmayan alanini iyonlaştırmaya yardımcı olarak belirleyici bir rolü bulunmaktadır. 2843 dalton ağırlığındaki melitin peptitine kadarki peptitler bu tür bir ‘’matris’’ ile karıştırıldığında iyonize yeteneğine sahip olabilmektedir. Büyük molekül boyutlu lazer desorpsiyon iyonizasyonu için çözüm olarak 1987 yıllarındaki çalışmalarda Koichi Tanaka ve arkadaşları ‘’ ultra ince bir metal sıvı matris yöntemi’’ olarak isimlendirdikleri yöntemi kullanmışlardır[10].
Bu kullanılan yöntemde iyonizasyon işlemi için 30 nm kobalt parçacıkları alınıp gliserol içeren ortamda 337 nm nitrojen bulunan lazere maruz bırakılıyordu. Daha sonra lazer ve matris kombinasyonu kullanılarak Tanaka 34.472 Dalton ağırlığındaki karboksipeptidaz-A proteini kadar büyük boyutlardaki biyomolekülleri iyonize etmeyi başarmıştı. Tanaka daha sonra lazer dalga boyu ve matrisinde uygun koşullar altındaki birleşimi ile bir proteinin iyonize edilebileceğini göstererek 2002 yılında Nobel Kimya Ödülünün ¼’üne sahip oldu. Karas ve Hillenkamp da daha sonraki yıllarda yapılan çalışmalarda başka bir deney düzeneği geliştirerek nikotinik asit matrisi ve 266 kDa ağırlığındaki albüminini iyonize etmeyi başarmıştır. Günümüzde ise bu yöntem daha çok organik matrislerin iyonize edilebilmesi için tercih edilmektedir[11].
Referanslar:
1. Croxatto, A., Prod'hom, G., & Greub, G. (2012). Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS microbiology reviews, 36(2), 380-407.
2. Opota, O., Prod’hom, G., & Greub, G. (2017). Applications of MALDI-TOF Mass Spectrometry in Clinical 9 Diagnostic Microbiology. 10.
3. Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., & Schubert, S. (2012). MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics—identification of microorganisms and beyond (mini review). Applied microbiology and biotechnology, 93(3), 965-974.
4. Holler, J. G., Pedersen, L. K., Calum, H., Nielsen, J. B., Tvede, M., Schønning, K., & Knudsen, J. D. (2011). Using MALDI-TOF mass spectrometry as a rapid and accurate diagnostic tool in infective endocarditis: a case report of a patient with mitral valve infective endocarditis caused by Abiotrophia defectiva. Scandinavian journal of infectious diseases, 43(3), 234-237.
5. Bizzini, A., & Greub, G. (2010). Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, a revolution in clinical microbial identification. Clinical Microbiology and infection, 16(11), 1614-1619.
6. Bittar, F., Ouchenane, Z., Smati, F., Raoult, D., & Rolain, J. M. (2009). MALDI-TOF-MS for rapid detection of staphylococcal Panton–Valentine leukocidin. International journal of antimicrobial agents, 34(5), 467-470.
7. Zhang, A., Sun, H., Wang, P., Han, Y., & Wang, X. (2012). Modern analytical techniques in metabolomics analysis. Analyst, 137(2), 293-300.
8. Liu, X., & Locasale, J. W. (2017). Metabolomics: a primer. Trends in biochemical sciences, 42(4), 274-284.
9. Goodacre, R. (2007). Metabolomics of a superorganism. The Journal of nutrition, 137(1), 259S-266S.
10. Karas, M., & Hillenkamp, F. (1988). Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical chemistry, 60(20), 2299-2301.
11. Karas, M., Bachmann, D., Bahr, U., & Hillenkamp, F. (1987). Matrix-assisted ultraviolet laser desorption of non-volatile compounds. International journal of mass spectrometry and ion processes, 78, 53-68.
12. Görsel1: https://www.klimud.org/public/uploads/dosya/1352727747. pdf, (Erişim: 26.10.2022).