beyaz logo.png

Mikrodizi Teknolojisi

Güncelleme tarihi: 4 Haz 2021


 

Gizem Ustabaş-Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı-Sağlık Bilimleri Enstitüsü-Hacettepe Üniversitesi, Yüksek Lisans

 

Gen çip olarak da bilinen mikrodizi (microarray) tekniği, Edwin Southern tarafından geliştirilmiş olan southern blot tekniğinden türemiştir[1]. Daha sonra zaman ilerledikçe modern mikroarray analizi Pat Brown ve Ron Davis liderliğinde 1995 yılında tanıtılmıştır[2]. Bu teknolojinin bilim insanlarına sağladığı en büyük avantajlardan biri, tüm genomun sadece bir çip üzerinde görüntülenmesiyken en çok dikkate değer kullanım alanı ise gen ifadesindeki farklılıkların ölçülmesidir. Eş zamanlı olarak birçok genin ekspresyonunu izlemek için geliştirilmiş olan yüksek kapasiteli bu sistem, cam, plastik veya silikon çip gibi katı bir yüzeye tutturularak dizili (array) bir şekilde oluşturulmuş mikroskobik DNA spotlarından oluşmaktadır. Brown ve Davis ekibinin çalışmaları Arabidopsis thaliana adlı hardal bitkisi geninin diferansiyel ekspresyon ölçümleri üzerine yapılmıştır[2]. Bu deney her ne kadar Arabidopsis’teki toplam genlerin küçük bir kısmını temsil eden 45 oligonükleotid dizisini tespit etmiş olsa da, birçok yeni deney bu çalışmadan ilham almış ve mayaların, bakterilerin, farelerin, insanların tüm genomları ortaya çıkmıştır[3].


Yaygın olarak kullanılmakta olan iki ana mikroarray platformu vardır; cDNA ve oligonükleotid.


Şekil 1: cDNA mikroarray prensibi[4].


cDNA klonları genelde birkaç yüz baz çiftinden birkaç kilobaza kadar değişmekte olup, mekanik veya mürekkep püskürtmeli mikrospotlama ile bir cam yüzey üzerine basılmaktadır (Şekil 1). Referans RNA ve deneysel RNA, ters transkriptaz kullanılarak sırasıyla floresan Cy5 veya Cy3 boyalarıyla farklı şekilde etiketlenmektedir. Sonraki cDNA'lar, gece boyunca dizilere hibridize edilmektedir. Ardından slaytlar yıkanmakta ve bir floresan lazer tarayıcı ile taranmaktadır. Örneklerdeki transkriptlerin nispi bolluğu, her bir spot dizi elemanı üzerindeki kırmızı/yeşil oranı ile belirlenebilmektedir[4]. Bu çalışma prensibine örnek olarak yukarıda da bahsettiğim Brown’un Arabidopsis çalışması örnek verilebilir[2]. cDNA mikrodizileri birçok avantaja sahiptir. Bunlardan birisi de; dizide spot boyutundaki veya cDNA prob miktarındaki değişikliklerin sinyal oranını etkilememesinden ötürü iki örnek arasındaki farkın güvenilir bir şekilde ölçülebilmesidir. Diğer yandan, oligonükleotid dizileriyle karşılaştırıldığında genel olarak daha ekonomiktirler. Tabi bunların yanı sıra bazı dezavantajları da vardır. İlk olarak, cDNA mikrodizisi büyük bir set halinde sıralanmış klonların toplanmasını gerektirmektedir. Ancak klonlar yanlış tanımlanabilmekte veya kontamine olabilmektedirler. Diğer bir problem olarak, yüksek sekans benzerliğine sahip genler, aynı klona hibridize olabilmekte ve çapraz hibridizasyon oluşturabilmektedirler. Bu tip problemlerin oluşmaması için, genelde kodlama dizileri ile karşılaştırıldığında çok daha farklı olan 3’ uçlu çevrilmemiş bölgelere sahip klonlar, mikrodizilerin üretilmesinde kullanılmalıdır[4].

Şekil 2: Affymetrix GeneChip prensibi[4].


En yaygın olarak kullanılan oligonükleotid dizileri, cam slaytlar üzerinde oligonükleotidlerin fotolitografiye yönelik sentezini kullanan Affymetrix tarafından üretilen GeneChip'lerdir (Şekil 2). Affymetrix GeneChip prensibinin amacı, örnekteki her bir transkript için mutlak seviyeleri ölçmektir. Genel olarak, her bir transkript için yaklaşık 20 farklı ve minimum düzeyde örtüşen 25-mer oligonükleotid seçilmekte ve dizi üzerinde sentezlenmektedir. Diğer yandan her bir oligonükleotid için merkezi konumda, mükemmel eşleşen (perfect match, PM) probdan bir nükleotid kadar farklılık gösteren bir çift yanlış eşleşme (mismatch, MM) kontrol oligonükleotidi vardır. PM oligonükleotitten gelen hibridizasyon sinyallerinin MM oligonükleotit ile karşılaştırılması, arka planın otomatik olarak çıkarılmasına izin vermiş olacaktır. Oligonükleotid dizilerinin de bazı avantajları vardır. Oligonükleotid dizilerinin sekansları, veri tabanından bilgilerin sekanslanması ve diziler için de novo sentezlenmesiyle belirlenebilmektedir. Bu sebeple, cDNA mikrodizisini yazdırmak için kullanılan cDNA klonlarını veya polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ürünlerini doğrulamaya gerek yoktur. Her bir transkript için çoklu oligonükleotidlerin kullanılması, aynı zamanda splays (splice) varyantlarının saptanmasına izin vermekte ve yüksek sekans benzerliklerine sahip genlerin ayırt edilmesine yardımcı olmaktadır. Bu dizilerin en büyük dezavantajı ise bunların yalnızca ticari üreticiler tarafından üretilebilmesidir[4].





Referanslar

1.Behzadi, P., Ranjbar, R. (2019). DNA microarray technology and bioinformatic web services. Acta microbiologica et immunologica Hungarica, 66(1), 19–30. https://doi.org/10.1556/030.65.2018.028

2.Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. (1995). Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science (New York, N.Y.), 270(5235), 467–470. https://doi.org/10.1126/science.270.5235.467

3.Brewster, J.L., Beason, K.B., Eckdahl, T.T., Evans, I.M. (2006). The microarray revolution: Perspectives from educators. Biochemistry and Molecular Biology Education, 32(4), 217-227 https://doi.org/10.1002/bmb.2004.494032040362

4.Chang, H. Y., Thomson, J. A., Chen, X. (2013). Microarray analysis of stem cells and differentiation. Handbook of Stem Cells, 399-407. http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-385942-6.00034-2


345 görüntüleme0 yorum

Son Paylaşımlar

Hepsini Gör