beyaz logo.png

Moleküler Genetik Tanı Yöntemleri

Ayça İrgit - Moleküler Biyoloji ve Genetik, Fen - Edebiyat Fakültesi, İstanbul Teknik Üniversitesi


Moleküler Genetik Tanı Yöntemleri

Moleküler tanı yöntemleri, genetik hastalıklara tanı konulmasında başvurulan temel yöntemlerdendir. Klinikte konulan tanılar, moleküler tanı yöntemleri ile de desteklenmektedir. Genetik hastalıkların moleküler genetik tanısında kullanılan temel yöntemlerden bazıları:

I. Polimeraz zincir reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction [PCR]),

II. DNA dizi analizi,

III. DNA mikroarray analizi,

IV. DNA hibridizasyonu,

V. Allel-özgü oligonükleotid analizi (Allele-Specific Oligonucleotid [ASO]) şeklinde sıralanabilir[1].


Polimeraz Zincir Reaksiyonu


Kary Mullis’in 1985 yılında DNA arama amacıyla keşfettiği PCR tekniği, hücrede doğal olarak kendiliğinden gerçekleşen DNA replikasyonunun tüp içerisinde in vitro olarak taklit edilmesiyle hedef DNA bölgesinin çok sayıda çoğaltılmasına dayanan bir nükleik asit amplifikasyon teknolojisidir[1,2]. PCR tekniği tanı ve araştırma olanaklarında getirdiği yenilikler sayesinde geliştiricisi Kary Mullis’e Nobel Ödülü kazandırmıştır[2]. PCR tekniği iki primer arasında kalan hedef DNA bölgesinin ısıya dayanıklı bir DNA polimeraz enzimi olan Taq polimeraz tarafından birkaç milyon kat çoğaltılmasını dayanan bir in vitro klonlama yöntemi olarak ifade edilebilmektedir. PCR tekniği DNA denatürasyonunun gerçekleştirildiği denatürasyon, primlerlerin hedef DNA bölgesine bağlandığı hibridizasyon (annealing) ve enzimatik DNA sentezinin gerçekleştiği uzatma (ekstansiyon) olmak üzere üç basamakta gerçekleşmektedir[1]. PCR tekniğinin ilk basamağı olan denatürasyon aşamasında, DNA’nın denatürasyonunu gerçekleştirmek amacıyla yüksek ısılara (94-95°C) ulaşılır. DNA denatürasyonu gerçekleştikten sonra, hedef DNA bölgesine primerlerin bağlanabilmesi için sıcaklık 55-72 °C arasına düşürülerek primer-DNA hibridizasyonu sağlanır. Son adımda ise sıcaklık Taq polimerazın optimum çalışma sıcaklığı olan 72-78°C’lere çıkarılarak hedef DNA bölgesinin replikasyonu tamamlanmaktadır[2]. Her döngünün sonunda DNA miktarı ikiye katlanmaktadır. PCR tekniğinde bu adımlar tekrarlanarak bir zincir reaksiyonu oluşmakta, başlangıçta az bir miktarda olan hedef DNA ile, 30-40 döngü sonunda birkaç milyon DNA kopyası elde edilebilmektedir[1].


Şekil1: PCR basamaklarının şematik gösterimi[3].


PCR tekniğinin kullanım alanlarından bazıları:

- DNA dizi analizlerinin oluşturulması ve büyük miktarda DNA örneklerinin oluşturulması

- Bilinmeyen DNA dizilerinin tayini

- Adli tıp uygulamaları

- Mutasyon analizleri

- Prob oluşturulması

- Klonlama ve gen ekspresyonu çalışmaları olarak sıralanabilir[1].


Özgün ve yüksek ölçüde duyarlı bir teknik olan PCR’ın kullanım alanları genişlemekte, yeni PCR teknikleri geliştirilmektedir. Hedef DNA bölgesinin analizi PCR ile çoğaldıktan sonra ASO, DNA dizileme, Mikroarray analizi, agaroz jel elektroforezi gibi metotlarla gerçekleştirilebilmektedir. Böylelikle, PCR moleküler araştırmalarda bir ön metod olarak kullanılmaktadır[1].


DNA Dizi Analizi


1977 yılında Frederick Sanger tarafından geliştirildiği için Sanger dizileme olarak da bilinen zincir sonlandırma (chain termination) yöntemi, DNA polimeraz enziminin deoksiribonükleozittrifosfatların (dNTP) yanısıra deoksiribozun 3’ pozisyonunda -OH grubu yerine -H taşıyan ve bu yüzden dideoksiribonükleozittrifosfatları (ddNTP) olarak adlandırılan nükleotitleri de substrat olarak kullanılması ile DNA dizi analizinin yapılmasına dayanmaktadır[4].


Şekil2: dNTP’nin ve ddNTP’nin şematik gösterimi[1].


Sanger yönteminde DNA dizi analizi, DNA polimerazı dNTP’lerin kimyasal analogları olan ddNTP’ler ile inhibe ederek gerçekleştirilmektedir[1]. ddNTP’nin sentezlenen DNA’ya rastgele bir sırada eklenmesi ile nükleotitin 3’ pozisyonunda OH grubu olmadığı için DNA polimeraz sonraki nükleotiti sentezlenen DNA’ya bağlayamamakta böylece DNA sentezi ddNTP’in eklenmesi ile son bulmaktadır. ddNTP’in rastgele eklenmesine bağlı olarak farklı uzunluklarda elde edilen DNA parçalarının elektroforezle tespiti yapılabilmekte ve DNA dizisi analiz edilebilmektedir[4].


Şekil3: Zincir sonlandırma ile yapılan dizi analizi reaksiyonu ve jel görüntüsünün şematik gösterimi[1].


Sanger yöntemi, birçok bitki ve hayvan genomunun dizi analizinin yapılmasında önemli katkılar sağlamıştır. Sanger yöntemi, biyoinformatik alandaki gelişmelerle birlikte yeni nesil dizileme tekniklerinin geliştirilmesine kadarki süreçte en yaygın kullanılan DNA dizileme yöntemi olarak kullanılmıştır. İnsan Genom Projesi’nde Sanger yönteminin getirmiş olduğu kısıtlamalar nedeniyle daha ucuz, daha kısa sürede daha çok dizileme yapmaya imkan veren, doğruluk oranı daha yüksek olan yeni gen dizileme tekniklerinin geliştirilmesine ihtiyaç duyulmuş ve böylece Yeni Nesil Gen Dizileme (Next Generation Sequencing [NGS]) Sanger yönteminin yerini almıştır[4].


Yeni Nesil Gen Dizileme yöntemi, DNA’nın rastgele kesilerek parçalara (fragmanlara) ayrılması (Fragmentation), adaptör diziler vasıtasıyla DNA parçalarının bağlanması (İmmobilization), genom kütüphanesinin oluşturulması (Genomic Library), emülsiyon damlalar (yağın içindeki su damlacıkları) içindeki boncuklar üzerinde bulunan genomik kütüphanenin amplifikasyonu (Amplification), DNA parçalarının dizilenmesi (Sequencing) ve bilgisayarda verilerin analizi (Data analysis) yapılması olmak üzere çeşitli basamaklar sonucunda DNA dizi analizinin yapılmasına dayanmaktadır. Böylece DNA’nın klonlanmadan çoğaltılmış tek zincir DNA’dan birkaç yüz milyondan birkaç milyara kadar bazın tanımlaması mümkün hale gelmiştir[4].





Referanslar

  1. Zaman, A. G. Genetik Tanı Yöntemleri, Türk Toraks Derneği Okulu

  2. Kahya, S., Buyukcangaz, E., & Carlı, K. T. (2013). Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Optimizasyonu. Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 32(1), 31-38.

  3. Babaoğlu, M. Ö., (2006), Farmakogenetik Çalışmalarda Temel Yöntemler, Türk Farmakoloji Derneği Eğitim Sempozyumu: Genetik Araştırmalarda Kullanılan Yöntemlerin Farmakolojide Uygulamaları, 4-26

  4. Kızmaz, M. Z., Paylan, İ. C., & Erkan, S. (2017). DNA Dizilemenin Tarihsel Gelişimi. Gaziosmanpaşa Bilimsel Araştırma Dergisi, 6(2), 47-53.


345 görüntüleme0 yorum

Son Paylaşımlar

Hepsini Gör