Moleküler Genetik Tanı Yöntemleri-II
Ayça İrgit - Moleküler Biyoloji ve Genetik, Fen - Edebiyat Fakültesi, İstanbul Teknik Üniversitesi
DNA Mikroarray Analizi
Tek bir array üzerinde tüm genomu incelemeye olanak veren DNA mikroarray (çip) yönteminin temeli, Solinas-Toldo ve arkadaşları tarafından 1997 yılında hedef DNA dizisini cam yüzey üzerinde immobilize edilmesi ile atılmıştır. Robotik teknolojilerdeki ve moleküler biyoloji genetik alanında yaşanan gelişmeler ile birlikte plastik ya da cam matriks üzerinde her bir geni temsil eden DNA parçasının sabitlenmesi ile geliştirilen arrayler, trankripsiyonun genomik bir ölçekte değerlendirilmesinde, gen ekspresyonu analizlerinde ve tek nükleotid polimorfizmlerinin (SNP) genotip analizlerinin yapılmasını mümkün kılmıştır. Tüm genomun çalışılabilmesi için küçük bir örnek hacminin yeterli olmasından dolayı mikroarray teknolojisi yüksek verimli teknolojiler arasında yer almaktadır. Standart bir mikroarray matriksi, yaklaşık olarak, bir cm2’sinde 100 µm çapında 40.000 spot (benek) içermektedir[1,2].
Şekil1: DNA mikroarrayin görünümü[2].
DNA mikroarray analizi,
1. Mikroarray’in hazırlanması
2. Test edilecek örneklerin hazırlanıp etiketlenmesi
3. Hibridizasyon
4. Yıkama
5. Etiketlerin uyarılması
6. Görüntü tarama / Veri işleme-analizi işlem basamaklardan oluşmaktadır[2].
Şekil2: DNA mikroarray işlem basamakları[2].
Şekil3: DNA Mikroarray hazırlanması[1].
Mikroarray analiz tekniğinin kullanım alanlarından bazıları:
- DNA dizi analizi
- Gen haritalanması
- Gen ekspresyon çalışmaları
- Gen ekspresyon farklarının incelenmesi
- Kanser araştırmaları
- Mutasyon ve polimorfizm tespiti
- SNP analizleri
- Epigenetik mutasyonlara yönelik çalışmalar
- İlaç hedeflerinin tanımlanması şeklinde sıralanabilir[1].
DNA mikroarray teknolojisi, birçok genin aktivitesinin aynı zamanda izlenebilmesi; farklı renklerde florokromların kullanılması ile genom boyunca DNA kopya sayısındaki değişimlere bağlı olarak görülen kromozom anomalilerinin tespit edilmesini ve sınıflandırılabilmesine olanak vermesi, hızlı bir yöntem olması; az miktarlarda DNA örneğinin analiz için yeterli olması, yüksek kararlılık ve verim elde edilen bir teknolojisi olması, DNA üzerindeki tek baz değişikliklerine (SNP) hassas olması, hasta ve sağlıklı hücrelerdeki genlerin aktivitelerinin karşılaştırılmasını sağlaması ve hastalıkları alt-gruplar halinde kategorize edebilme gibi avantajlarının yanı sıra, heterojen doku ve hücre popülasyonları ile çalışmanın zorluğu, standardizasyonun zorluğu, tek bir seferde çok fazla veri analizi yapıldığından, tüm sonuçların analizinin zaman alması; sonuçların yorumlamak için çok kompleks olabilmesi; sonuçların yeterince kantitatif olmaması ve oldukça pahalı bir teknoloji olması gibi bazı dezavantajlara da sahiptir[1,3].
DNA Hibridizasyonu
Moleküler genetikte kullanılan ilk hibriditasyon yöntemi, 1975 yılında Edwin Southern tarafından geliştirilmiş olan ve DNA-DNA hibriditasyonuna dayanan mucidinin soyadı ile birlikte anılan Southern blot yöntemidir[3]. Southern blot yöntemi, agaroz jel elektroforezini tamamlayıcı (komplamenter) DNA dizisinin hibridizasyonuna dayandırmaktadır[4].
Southern Blot yöntemi,
1. Genomik DNA’nın izolasyonu
2. Spesifik restriksiyon endonukleaz (RE) enzimi ile kesim
3. Fragmentlerin elektroforezi
4. Bantların membran üzerine transferi (Southern transfer)
5. Denaturasyon ve fikzasyon
6. Hibridizasyon
7. Otoradiografi işlem basamaklarından oluşmaktadır[5,6].
Şekil4: Southern Blot analizi[7].
Southern blot yöntemi ile, elektroforez sonucunda oluşan bantlaşma karakterine göre genin varlığı/yokluğu ya da büyüklüğü hakkında bilgi edinilebilmektedir[4].
Allel-Özgü Oligonükleotid Analizi
ASO yöntemi, hastalığa neden olan genetik mutasyonun bilindiği hastalıklar için hasta DNA’sında hastalıkla ilgili mutasyonun varlığının ya da yokluğunun incelendiği bir moleküler genetik tanı yöntemidir. Bu yöntemde, biri normal gene özgül diğeri ise ilgili mutasyona özgül olmak üzere iki sentetik oligonükleotit prob kullanılmaktadır. Kullanılan problar, sadece tamamlayıcı (komplamenter) DNA dizisi ile hibridize olarak hibridizasyona engel olan tek bir baz uyuşmazlığını bile saptamaya olanak verecek derecede hassastır[1].
Şekil5: ASO analizi[1].
İlgili hastalığın homozigot ve heterozigot genotipini taşıyan bireylerin ayırt edilmesinde ASO yöntemi kullanılabilmektedir. ASO yöntemiyle sadece neden olduğu mutasyon bilinen ve az sayıda mutasyon ile karakterize olan hastalıklar için DNA analizi yapılabileceği için yöntemin kullanımı sınırlıdır[1].
Referanslar
1. Zaman, A. G. Genetik Tanı Yöntemleri, Türk Toraks Derneği Okulu
2. Bal, S. H., & Budak, F. (2012). Mikroarray Teknolojisi. Uludağ Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi, 38(3), 227-233.
3. Yoltaş, A., & Karaboz, İ. (2010). DNA mikroarray teknolojisi ve uygulama alanları. Elektronik Mikrobiyoloji Dergisi TR, 8, 01-19.
4. Erçal, M. D. (2002). Prenatal Sitogenetik, Moleküler Genetik Tanı ve Yenilikler. Journal Of Clinical Obstetrics & Gynecology, 12(4), 320-324.
5. Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Hibridizasyon Yöntemleri, Erişim Adresi: https://acikders.ankara.edu.tr/pluginfile.php/6160/mod_resource/content/1/11.%20Hafta.pdf
6. Tezel, G. G., Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot, Erişim Adresi: http://www.turkpath.org.tr/pdf/7kasim/gaye_guler_tezel_molekuler2.pdf
7. Zengin, T., Protein Saflaştırma Teknikleri, Erişim Adresi: https://slideplayer.biz.tr/slide/13626284/