N6-Metiladenozin Modifikasyonunun mRNA Üzerindeki Etkisi


Ali Aslan - Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, Biruni Üniversitesi

N6 -Metiladenozin(m6A), mRNA üzerinde çeşitli değişiklikler meydana getiren oldukça yaygın bir modifikasyon türüdür. Metiladenozin, ökaryotik transkriptom üzerinde mRNA’nın transkripsiyon sürecini, splicing, translasyon aşamalarını ve gerektiğinde mRNA bozulmasını sağlar.[1] Özellikle transkripsiyon sonrası modifikasyonlarda genlerin düzenlenmesinde rol oynar. Yapılan çalışmalarda, 150’ye yakın transkripsiyon sonrası modifikasyonlarla ilişkili mRNA, tRNA, rRNA ve kodlanmayan RNA(ncRNA) gibi çeşitli RNA türleri olduğu görülmüştür.[2-4]

Metiladenozinin keşfedilmesi 1970’lere kadar dayansa da RNA sekanslama tekniklerinin geliştirilmesi ve proteinlerin ayrıntılı analizleri ile birlikte son yıllarda tekrardan ayrıntılı bir şekilde incelenmeye başlanmıştır.[5,6] Araştırmacılar bu modifikasyon türünü memeli hücrelerinde keşfettiler. Çeşitli memeli hücrelerinde mRNA’da ifade edilen bu modifikasyon, mRNA’nın splice edilmesinde, translasyon faaliyeti için çekirdek dışına taşınma sürecinde ve translasyon süreci esnasında kritik roller üstlenmektedir.[7] Ayrıca bu modifikasyonun spermatogenez, nörogenez gibi süreçlerde de rol aldığı bilinmektedir.[8,9] Her ne kadar moleküler düzeyde hayati öneme sahip işlevlerde rol alsa da, sürecin bozulması ile beraber kanser oluşumuna da katkısı olduğu görülmüştür.[10-12] Metiladenozin’in mRNA üzerindeki konumuna bakıldığında özellikle translasyon durdurma kodonu çevresinde ve 3’ çevrilmemiş bölgede(UTR) yoğun olduğu görülmektedir.[13-15] Ortalama olarak her 1000 nükleotitte 1-2 adet m6A yapısı bulunmaktadır.[16,17] “RRACH” dizilerinde daha çok meydana geldiği görülmüştür. Burada R Adenin(A) ya da Guanin(G)’e, H, A, C ya da Urasil(U)’e denk gelmektedir.[18,19]


Metiladenozin modifikasyonu hakkında yapılan araştırmalarda elde edilen bulgulara göre bu sistem, dinamik ve tersinmez bir sistemdir. Ayrıca bu sistemin yürütülmesinde görev alan bazı protein grupları mevcuttur. Bu protein grupları işlevlerine göre, “yazıcılar”, “siliciler” ve “okuyucular” olarak ayrılmaktadır.



Şekil 1: m6A modifikasyonunu oluşturan protein gruplarının mRNA üzerinde gösterimi.[20]

Yazıcılar diğer adlarıyla metiltransferazlar olarak bilinen proteinler, mRNA üzerindeki belirli bölgeleri metilleme rolünü üstlenir.[21] Siliciler olarak adlandırılan gruplar ise demetilaz proteinleridir. Bu grup, belli bölgelerdeki metil gruplarının kaldırılmasında rol oynarlar.[22] Bu grup proteinler bir araya gelip kompleks yapılar oluşturabilirler. Bu komplekslere örnek olarak yazıcılar grubunda yer alan Metiltransferaz benzeri protein 3(METTL3) ve Metiltransferaz benzeri protein 14(METTL14)’ün oluşturmuş olduğu m6A –METTL kompleksidir(MAC). Bu kompleksin işlevleri arasında DRACH (burada D = A, G veya U; R = purin; ve H = A, C veya U) motifini tanıma ve transkripsiyon sürecini hızlandırma yer almaktadır.[23] Başka bir kompleks yapısı da METTL3’ün METTL14, Wilms Tümörü 1 ilişkili protein(WTAP), Metiltransferaz ilişkili Vir benzeri m6A(VIRMA), RNA bağlanma motifi 15(RBM15) ve çinko parmak CCCH tipi içeren 13(ZC3H13) gibi diğer yardımcı alt birimlerle oluşturduğu Metiltransferaz kompleksidir(MTC).[24] Bu protein kompleksinin içerisinde bulunan proteinlerin her birinin farklı görevleri vardır. METTL3, METTL14 ile birleşerek stabil bir kompleksin oluşmasını sağlar.[25-27]WTAP ise, METTL3-METTL14 heterodimerinin nükleer noktada lokalizasyonunu sağlar ve katalitik etkinliği destekler.[28,29]


Şekil 2: Metiltransferaz kompleksi ve kompleksi oluşturan alt birimlerin birbirleriyle olan etkileşimleri. METTL3-METTL14 kompleksi(MAC) başka alt birimlerle birleşerek daha kompleks bir yapı olan Metiltransferaz kompleksini(MTC) meydana getirir.[30]

Yazıcılar kısmına detaylıca değinilecek olursa, METTL3, translasyon sonrası modifikasyonlarda hedef mRNA’nın düzenlenmesinde kısmi olarak okuyucu görevi de üstlenir. Ayrıca METTL3, kendini yenileme ile ilişkili olan p21 ve Nr4a2 gibi genlerin ifadesini etkinleştirerek hematopoetik kök hücrelerin(HSC) kendini yenileme özelliği kazanmasını sağlar.[31-33] METTL3’ün yeterli düzeyde etkinleşmemesi, HSC’nin bu özelliğinin büyük ölçüde bastırılmasına neden olur.[34]

Histon H3 lizin trimetilasyonu(H3K36me3), METTL14’ün m6A ifadesini tanıyıp bağlanmasını sağlar. METTL14’ün diğer bir görevi, metiltransferaz kompleksinin(MTC) RNA Polimeraz II’ye bağlanmasını sağlamaktır, bu sayede MTC’yi kopyalanmış olan etkin RNA’lara bağlamış olur.[35] Ayrıca METTL14’ün HSC’ler üzerinde de etkisi olduğu düşünülmektedir. Yapılan araştırmalarda, METTL14’ün Epstein-Barr virüsü(EBV) tarafından enfekte edilen hücrelerin proliferasyonunda görev aldığı görülmüştür. METTL14, EBV’ye özgü bir antijen olan EBNA3C üzerinde m6A’yı indükleyerek kanser oluşumuna neden olur. Bu sayede METTL14, EBNA3C’nin ifadesini arttırmasına ve kararlı hale gelmesine yardımcı olur. İlginç bir şekilde EBNA3C de METTL14’ün kararlı yapıda olmasına yardımcı olmaktadır.[36]


Diğer bir Metiltransferaz üyesi olan METTL16, uzun kodlanmayan RNA’ların ve U6 küçük nükleer RNA’nın metillenmesinden sorumludur.[37] Ayrıca METTL16, DNA ve histon metilasyonunda önemli bir rolü olan S-adenozilmetiyonin(SAM)’i düzenler. SAM’ın sentezlenmesi MAT2A tarafından sağlanmaktadır. SAM’ın eksikliğinde METTL16, intronların splice edilmesini sağlayarak MAT2A ve SAM’in ifadesinin artmasını sağlamaktadır.[38]


Bir METTL3 adaptör proteini olan WTAP, herhangi bir biyokimyasal işlev olmaksızın mRNA splicing’e katılmaktadır. Ayrıca WTAP’ın hücre döngüsünde ve erken embriyo gelişiminde rol oynadığı bilinmektedir.[39,40] WTAP-METTL3 kompleksinin oluşumu m6A modifikasyonu için gereklidir.


Yapılan proteomik analizlerde VIRMA’nın WTAP’ın en önemli interaktörlerinden biri olduğunu ortaya çıkardı.[41] Memeli hücrelerindeki VIRMA eksikliği m6A’nın belirgin ölçüde kaybına yol açmaktadır. VIRMA, spesifik bölünme ve poliadenilasyon spesifite faktörlerini (CPSF5, CPSF6) bir araya getirerek daha uzun 3′ UTR bölgesi oluşumunu sağlar.[42]


WTAP’ın VIRMA dışında başka interaktörleri de olduğu ortaya çıkarıldı. Metilasyondan sorumlu olan RBM15/RBM15B, METTL3 ile etkileşim kurarak m6A’nın etkinleşmesini sağlamaktadır. RBM15/RBM15B’nin knock-out edilmesi mRNA’da m6A’nın azalmasına yol açmaktadır.[43] Diğer yazıcı bileşenleri de aynı şekilde m6A modifikasyonunun gerçekleşmesinde rol oynamaktadır.

Siliciler ise yazıcıların aksine m6A’yı kaldırarak demetilasyonun oluşmasını sağlarlar.[44] Her ne kadar erken m6A incelemeleri, m6A silicilerinin, dinamik, hızlı, sinyale bağlı bir şekilde kaldırılmasını katalize ederek m6A işlevi için kritik olması gerektiğini öne sürse de son yapılan çalışmalar, m6A silicilerinin kısıtlı işlevleri olduğunu gösterdi. Ayrıca yapılan bir çalışmada HeLa hücrelerinin yaşam döngüsünde mRNA üzerindeki m6A düzeylerinin durağan olduğu görüldü.[45,46]

Siliciler de yazıcılar gibi çeşitli türde protein grupları içermektedir. Yağ kütlesi ve obezite ilişkili protein (FTO), Fe(II)/α-ketoglutarat bağımlı dioksijenazların, AlkB alt ailesinin bir üyesidir.[47] FTO, Serin ve Arjinince zengin splicing faktör 2(SRSF2)’nin splice bölgesine bağlanmasını engelleyerek mRNA splicing’i kontrol eder.[48] Araştırmada, FTO’nun m6A modifikasyonunda α-ketoglutarat’ı demetilleyerek RNA demetilasyonunu ve Fe2+ bağımlı süreçleri katalizlediği görülmüştür.[49-52] FTO, siklin A2 ve siklin bağımlı kinaz 2’de(CDK2) m6A düzeylerini düşürerek YTHDF2 aracılı mRNA yıkımını durdurur. Böylece yağ hücre döngüsüne ve adipogeneze katkıda bulunur.[53] Ayrıca, FTO’nun akut myeloid lösemide onkojenik rolü olduğu da bilinmektedir.



Şekil 3: FTO, diğer bir demetilaz bileşeni olan ALKBH5 ile birlikte mRNA üzerindeki metilasyonu kaldırır. Aynı zamanda FTO, Poli A kuyruğundaki metilasyonu da kaldırmaktadır.[54]

α-ketoglutarat bağımlı dioksijenaz Alk B homolog 5(ALKBH5), demetilaz proteini diğer silici proteinler gibi mRNA üzerinde çeşitli bölgelerde metilasyon kaldırma işlevini üstlenmektedir. Fare modelleriyle yapılan bir çalışmada, ALKBH5 eksikliğinde tübüler mRNAda m6A modifikasyonunun seviyesinin arttığı ve sonuç olarak da farelerde testis atrofisiyle birlikte sperm sayılarında azalma görüldüğü bildirilmiştir.[55] Bu çalışma, ALKBH5’in spermatogenezde rol oynadığını ve demetilasyon yoluyla spermatogenezi düzenlediğini göstermiştir. Genotoksik stres varlığı ya da hipoksi uyarımı gibi durumlarda ALKBH5, protein arjinin metiltransferaz(PRMT7) tarafından düzenlenir. Bu da ALKBH5’in farklı biyolojik süreçlerde geniş bir rol oynadığını göstermektedir.[56,57]


Şekil 4: ALKBH5/FTO aracılı demetilasyon süreci. 2-Oksoglutarat’ın Fe (II) / 2-Oksoglutarat bağımlı Dioksijenaz enzimleri tarafından Süksinat’a okside olduğu görülmektedir. Ayrıca N6-methyladenine(m6A)’in metil grubu kaldırılmasıyla adenine dönüşmektedir.[58]

Metiladenozin modifikasyonlarının son protein grubu olan okuyucular, mRNA’nın gidişatını belirlemek ve kontrol etmek için m6A bölgelerine bağlanırlar.[59] YTH alanı ailesi, kendi içerisinde farklı görevlere sahip okuyucu proteinleri barındırır. YTHDF1, başlatıcı faktörlerle etkileşim kurarak protein sentezini ve mRNA translasyonunu geliştirir.[60] YTHDF2 ise m6A tarafından modifiye edilmiş mRNA bölgesine bağlanarak mRNA yıkımını sağlar.[61] Diğer bir YTH alanı ailesi üyesi olan YTHDF3, hem negatif hem pozitif düzenlemelerde rol oynayarak çift yönlü çalışmaktadır. RNA translasyonunun geliştirilmesinde YTHDF1 ile etkileşime girer. YTHDF3, aynı zamanda YTHDF2 ile birlikte mRNA yıkımını sağlamaktadır.[62,63]

YTH alanı ailesi üyelerinin diğer etkilerine bakıldığında, YTHDF1 tümör neoantijenleriyle yakın bir ilişkisi vardır. Tümör antijenleri, anti-tümör immün yanıtını düzenlemede ve immünoterapide rol oynamaktadır. YTHDF1, dendritik hücrelerde bulunan neoantijenlerin m6A modifikasyonunu tanıyarak lizozomal proteazlar tarafından yıkılmasını engeller. Bu sayede tümör antijenlerin T hücrelerine sunan dendritik hücrelerin etkinliği bastırılmış olur ve tümör antijenleri immün gözetiminden kaçmış olur.[64] YTHDF2, mRNA deadenilasyonunda ve bozulmasında rol oynar. Ayrıca, YTHDF2, Isıya duyarlı protein(HRSP2) ve RNaz P/MRP ile kompleks oluşturarak m6A ile metillenmiş RNA endoribonükleolitik ayrılmaya aracılık eder. YTHDF2’nin miRNA ile de etkileşim kurduğu bilinmektedir. Bir araştırmada Prostat kanserinde YTHDF2 ifadesi miR-493-3p tarafından baskılanarak hücre proliferasyonunun ve hücre göçünün bozulması sağlanmıştır.


Şekil 5: mRNA yıkımı YTHDF2 aracılığı ile çeşitli şekillerde gerçekleştirilir. A)HRSP12-RNAse P/MRP kompleksiyle mRNA orta bölgeye yakın bir yerden RNAse P/MRP enzimi tarafından kesilir. B)mRNA CCR4/NOT kompleksiyle Poli A kuyruk bölgesinden kesilir. C)mRNA, 5-Cap bölgesinin kesilmesiyle de yıkıma uğratılır.[65]

Diğer bir YTH alanı ailesi olan YTHDC’ler de m6A modifikasyonunda okuyucu olarak rol oynamaktadır. YTHDC1, kodlanmayan RNA(ncRNA) üzerinde m6A bölgelerine bağlanarak ncRNA’nın splice edilmesini ve çekirdek dışına çıkarımını sağlar. Ayrıca YTHDC1, X inaktif spesifik transkript(XIST) adı verilen ncRNA ile de etkileşim halindedir. YTHDC1, XIST üzerindeki m6A’yı tanır ve XIST’in i