PCR Mekanizması ve Korona Virüs Tanısında Kullanımı
Elif Şenkuş – Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) DNA’nın belirli bir bölgesinin milyonlarca kopyasını oluşturan bir laboratuvar tekniğidir. PCR’ın çalışma mekanizması ısı ile ilgilidir. PCR makinesi termal döngü olarak adlandırılan DNA’ yı içeren çözeltiyi defalarca ısıtılıp ve soğutulması işlemini gerçekleştirir. PCR moleküler biyolojinin birçok alanında kullanılır. Adli tıpta suç mahalinden alınan örnek ile şüpheli tespitinde, babalık testinde, kanser, genetik hastalıkların tanısı ve mikrobiyoloji gibi çeşitli alanlarda uygulamaları bulunur. PCR testi ile bulaşıcı hastalıkların tespiti de yapılmaktadır. Dünyamızın Korona virüs pandemisiyle mücadele ettiği bugünlerde PCR testi hastalığın teşhisi için tercih edilen bir testtir. [1,2]
PCR işleminin gerçekleşmesi için gereken bileşenler:
1. kalıp DNA
2. primer
3. Taq polimeraz enzimi
4. nükleotitler (adenin, guanin, sitozin ve timin)
5. MgCl2
6. reaksiyon tamponu
DNA replikasyonunda olduğu gibi burada da DNA’nın yeni ipliğinin oluşması için bir enzime ihtiyacımız var. PCR’da kullanılan bu enzim ısıya dayanıklı Taq polimeraz enzimidir. Taq polimeraz, ısıyı seven ‘‘Thermus Aquaticus’’ isimli bakteriden alınan bir enzimdir. Primerler, DNA’nın hedef bölgesine bağlanacak şekilde tasarlanmış tek iplikli küçük parçalarıdır. Genellikle 18-22 nükleotit içerirler. F (forward) ve R (reverse) primer olarak adlandırılan iki çeşit primer bulunur. İki çeşit primer olmasının sebebi DNA’nın ipliklerinin birbirine zıt olmasından dolayıdır. Bu primerler DNA’nın ayrılmış olan ipliklerine 5’-3’ yönünde bağlanırlar. Primer tasarlanması hedef bölgenin sentezlenmesi için büyük öneme sahiptir. [2,4]
PCR işlemi 3 ana adımdan oluşmaktadır.
Denatürasyon: DNA, iki ipliğinin birbirinden ayrılması için ısıtılır. Bu işlem 94 C’ de gerçekleşir.
Primer bağlanması: Sıcaklık 55-65 C’ ye düşürüldüğünde primer DNA’nın hedef bölgesine bağlanır.
Uzama: Sıcaklık 72 C’ye yükseldiğinde Taq polimeraz enzimi nükleotitleri tamamlayıcı bir şekilde dizer ve primeri uzatarak DNA’nın yeni ipliğini sentezler.
Bu 3 adım tekrarlanarak DNA’nın hedef bölgesi milyonlarca kez çoğaltılabilir. 1 döngü sonucunda 2 yeni DNA kopyası sentezlenmiş olur. 2 döngüde 4, 3 döngüde ise 8 DNA kopyası oluşur. Oluşan kopyalar döngü sayısına orantılı olarak 2n formülüyle hesaplanır. (n= döngü sayısı)
PCR sonuçlarının analizi PCR işlemi tamamlandıktan sonra DNA agaroz jel elektroforezi yöntemi ile analiz edilir. [2]
Gerçek Zamanlı Ters Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (rRT-PCR)
Gelişen teknolojiyle birlikte gerçek zamanlı PCR bize sonuçları beklemeden eş zamanlı olarak görmemizi sağlıyor. Gerçek zamanlı PCR, mikrobiyoloji laboratuvarlarında patojenlerin tespitinde kullanılır. Korona virüs tespitinde de bu yöntem kullanılmaktadır. Floresan boya sonuçları tespit etmede büyük önem taşır. RT- PCR , elektroforez yöntemine ihtiyaç duymadan sonuçları analiz edebilmemize olanak tanır. SYBR-Green I adlı boya PCR sonucunda üretilen çift iplikli DNA’ya spesifik olmadan bağlanarak ışıma yapar. Primerler bağlanıp uzama başladığında floresan boya çift zincirli DNA’nın arasına girer. Döngü arttıkça çift zincirli DNA’lar artacağından floresan boya da artar ve bu artış eş zamanlı olarak RT-PCR makinesinden gözlenir. [2,3]
Ayrıca floresan ile işaretlenmiş problar da ışıma için kullanılabilir. Problar da primer gibi tasarlanan küçük parçalardır. Primer bağlandıktan sonra onlar da spesifik olarak DNA’nın bir bölgesine bağlanır ve daha sonra uzama gerçekleşir. Prob kullanmak bize daha kesin sonuçlar verecektir. Çünkü eğer primerler yanlışlıkla birleşip DNA ya benzer dimer denen ikili yapı oluşturmuşsa SYBR-Green bu yapıyı DNA gibi algılayıp arasına girerek ışıma yapabilir. Fakat prob kullanırsak, spesifik olarak DNA’nın hedef bölgesine bağlanacağından daha kesin sonuçlar elde edebiliriz. [2]
Korona virüsü genetik materyal olarak tek iplikli RNA içerir. Test aşamasını kısaca özetlersek ilk olarak boğaz ya da ağızdan örnek alınır. Örneğe RNA ekstraksiyonu yapılır. Ekstraksiyon yapılmış viral RNA’ya ters transkripsiyon yapılarak tamamlayıcı DNA ipliği (cDNA) oluşturulur. Böylece RNA DNA’ya çevrilir. Bu işlemi ters transkriptaz enzimi yapar. Sonra PCR işlemi başlar. Bu işlemler geliştirilen kitler sayesince kolayca yapılabilir. Kitler RNA ekstraksiyonu, ters transkripsiyon gibi işlemler için gerekli olan materyale sahiptir. Eğer toplanan örnek virüs içeriyorsa primer genetik kodun spesifik bölgesine bağlanacak ve DNA sentezlenecektir. Floresan probun sebep olduğu ışıma hedef DNA’nın gerçek zamanlı olarak tespit edilmesini sağlayacaktır.
PCR Testinin Güvenilirliği
PCR testinin sonuçlarını almak yaklaşık 3 saat sürse de diğer hızlı tanı testlerine göre daha güvenilir sonuçlar vermektedir. Çünkü test virüsün RNA’sı kullanılarak yapılıyor. Antikor testleri yanlış çıkabilir. Çünkü kişi hastalığın erken evresinde ve vücudu daha antikor geliştirmemiş olabilir. Bunun dışında hastalık kişiye bulaşmış olabilir ama kişinin vücudu virüse karşı antikor üretmemiş de olabilir. Bu yüzden PCR testleri daha güvenilir diyebiliriz. Fakat her zaman PCR makinesinin de doğru çalıştığı kontrol edilmelidir. Örnek toplanırken dikkatli olunmalı, örnek toplanması sterilize (mikroplardan arındırılmış) bir alanda olmalı ve örneği toplayan kişi de gerekli koruyucu kıyafetleri giymelidir. Örneğin analiz edildiği laboratuvar da ayrıca sterilize olmalı ve çalışma alanları diğer mikroorganizmalardan arındırılmış olmalı. Aksi durumda toplanan örneğe diğer organizmaların bulaşması halinde yanlış sonuçlar gözlenebilir. Hasta ilk belirtileri gösterdiği anda testi yaptırmalıdır. Çünkü zaman ilerledikçe kişi hastalığa karşı bağışıklık kazanmış olabilir. Dolayısıyla hasta daha önce enfekte olup testi geç yaptırırsa negatif çıkma ihtimali yüksektir. [5,6]
Referanslar
1. Stephenson, F. H. (2016). Forensics and Paternity. Calculations for Molecular Biology and Biotechnology, 3, 439-463 https://doi.org/10.1016/B978-0-12-802211- 5.00013-8
2. Tang, S. ve Rothman, R. E. (2004) PCR- based diagnostics for infectious diseases:uses, limitations, and future applications in acute-care settings. Lancet Infectious Diseases 4(6), 337-348 Doi: 10.1016/S1473-3099(04)01044-8
3. Marmiroli, N. ve Maestri, E. (2007). Chapter 6 – Polymerase chain reaction (PCR) Food Toxicant Analysis. 147-186 https://doi.org/10.1016/B978-044452843-8/50007-9
4.16.06.2020tarihinde https://www.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna- technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr adresinden erişildi.
5.18.06.2020tarihinde https://web.archive.org/web/20200130202031/https://www.cdc.gov/coronavirus/2019- ncov/lab/rt-pcr-detection-instructions.html#quality-control adresinden erişildi
6. Espy, M., Uhl, J., Sloan, L., Buckwalter, S., Jones, M., Vetter, E., Yao, J., Wengenack, N., Rosenblatt, J., Cockerill, F., Smith, T. (2006) Real-Time PCR in Clinical Microbiology:Applications for Routine Laboratory Testing Clinical Microbiology Reviews, 165-256 Doi: 10.1128/CMR.19.1.165-256.2006
7. Şekil 1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.ht
ml?title=Click%20on%20image%20to%20zoom&p=PMC3&id=7106425_gr1_lrg.jpg
8.Şekil2https://ars.els-cdn.com/content/image/3-s2.0-B9780123847300004377-f00437-01- 9780123847300.jpg?_
9.Şekil3https://www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title= Click%20on%20image%20to%20zoom&p=PMC3&id=7106425_gr2_lrg.jpg
10.Şekil4https://i.insider.com/5e962cdb0b3c9b0ffa20727c?width=1136&format=jpeg
11. Kapak Fotoğrafı https://bioinfoinc.com/wp-content/uploads/2016/07/RT-PCR.jpg