Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)


Gülşah Sevimli - Moleküler Biyoloji, Genetik ve Biyomühendislik, Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi, Sabancı Üniversitesi

1983’de Kary Mullis tarafından bulunan polimeraz zincir reaksiyonu günümüzde en önemli ve çokça kullanılan moleküler biyoloji tekniklerinden biridir. Bu teknik, hedef DNA parçasının bir tüp içerisinde enzimatik reaksiyonlar sonucunda milyonlarca kopyasının oluşturulmasına dayanmaktadır. PCR viral ve bakteriyal hastalıkların tespiti, kalıtsal hastalıklarda hasta ve taşıyıcının belirlenmesinde, adli tıp, mikrobiyoloji, klonlama çalışmalarında, nokta mutasyonlarının belirlenmesi gibi birçok alanda kullanılmaktadır[1].


DNA örneği, primer, Taq polimeraz enzimi, reaksiyon tamponu, dNTP, su ve PCR cihazı (thermocycler) PCR tekniğinin gerçekleştirilmesi için gerekli olan temel parçalardır[1]. PCR’da hedef DNA, büyük ve karmaşık bir DNA dizisinden çoğaltılmak istenen küçük ve belirli bir DNA parçasını ifade etmektedir. Primerler bu teknikte hedef DNA molekülünün çoğaltılmasında görev alan en önemli içeriklerden biridir[1]. Genellikle 16-30 nükleotitden oluşan sentetik DNA parçaları olan primerler, çoğaltılacak olan hedef DNA parçasının başlangıcı (forward primer) ve sonunu (reverse primer) belirlemektedir[1]. Primerin uzunluğu, erime sıcaklığı ve spesifikliği gibi parametreler PCR sonucunu etkileyebilmektedir. Termofilik bir bakteri olan Thermus aquaticus’dan izole edilen Taq DNA polimeraz, yüksek sıcaklıklarda aktif olan standart PCR enzimidir[1]. Polimeraz, her bir primerden tamamlayıcı bir zincir oluşturmaktadır. Uygun sıcaklıkta primerin hedef DNA bölgesine bağlanmasından sonra, hedef DNA üzerinde adenin (A) nükleotidi varsa enzim primer dizisine timin (T) nükleotidini, guanin (G) nükleotidine karşılık olarak sitozin (C) nükleotidini eklemektedir[1]. PCR’da kullanılan tampon çözeltiler, enzim kofaktörü olarak görev alan Mg2+ katyonlarını içeren magnezyum klorür (MgCl2) içermektedir[1,2]. Son olarak, deoksinükleotid trifosfatlar (dNTP) sıvı içerisinde bulunan serbest nükleotitleri oluşturmakta ve bu nükleotitler Taq polimeraz tarafından yeni DNA zincirine eklenmektedir[2].


Şekil 1 : Thermus aquaticus’dan izole edilen Taq Polimeraz enzim yapısı [1].


PCR tekniği bozundurma (denaturation), bağlanma (annealing) ve uzama (elongation) olmak üzere 3 aşamadan oluşmaktadır. Bozundurma aşamasında belirli bir süre (15 sn. – 10 dk.) yüksek sıcaklığa (94-96 °C) maruz bırakılan DNA zinciri iki parçaya ayrılmaktadır. Bağlama aşamasında, hedef DNA bölgesine özel tasarlanan primer dizisinin sahip olduğu erime sıcaklığının en fazla 5 °C altında bir sıcaklıkta (50-65 °C) belirli bir sürede (30 sn. -2 dk.) açılmış olan DNA zincirlerine primerlerin bağlanması hedeflenmektedir. Son olarak uzama aşamasında, genellikle 72 °C’de Taq polimeraz tarafından serbest nükleotitler kullanılarak hedef DNA zinciri tamamlanmaktadır. Çoğaltılacak hedef DNA zincirinin uzunluğu, bu aşamada sürenin belirlenmesinde önemli bir etkendir. Çoğaltma işlemi 1-2-4-8-16-32 şeklinde logaritmik olarak artmakta ve reaksiyon sonunda milyonlarca hedef DNA örneği elde edilmektedir[1].


PCR çeşitleri yapılan çalışmanın koşullarına göre değişmektedir. Konvansiyonel PCR, yukarıda anlatılan temel malzemeleri ve aşamaları içeren PCR çeşitlerinden biridir[1]. Hedef DNA konvansiyonel PCR yöntemi ile çoğaltıldıktan sonra, agaroz jel elektroforez yöntemi ile analiz edilebilir[1]. Bu yöntemde polisakkarit olan agaroz, içerisinde Tris, asetik asit ve etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) bulunduran bir tampon çözelti içerisinde iyice çözdürülerek jel oluşturulmaktadır[2]. Bu karışım içerisine DNA’ya bağlanan ve UV altında dörünmesinde yardımcı olan bir boya kullanılmaktadır (etidyum bromür vb.)[2]. Tampon çözelti içerisindeki tris ve aseti asit sırasıyla asit ve baz olmakla beraber ortam pH’ının ayarlanmasında görev almaktadır. EDTA ise PCR sırasında kullanılan reaksiyon tamponu içerisinde yer alan Mg2+ tutmakla görevli bir şelatördür[1]. Uygun voltaj (80-120 V) ve zamanda referans DNA yardımı ile PCR sonucu elde edilen ürünler jel üzerinde UV ışık yardımıyla kontrol edilebilmektedir[2]. Bu aşamada önemli olan, hedef DNA’nın sahip olduğu baz sayısına göre hazırlanacak olan jelin konsantrasyonunu belirlenmelidir[2].


Diğer bir PCR çeşidi olan multipleks PCR, aynı DNA örneğinin farklı segmentlerinin birden fazla primer seti kullanılarak çoğaltılması işlemine dayanmaktadır[1]. Tek bir tüp içerisinde bir DNA örneğinden farklı bölgeler çoğaltılmak istendiği için, istenen bölgelere özgü primerler uzunluk, erime sıcaklığı gibi parametreler göz önünde bulundurularak tasarlanmalı ve bu primerler öncesinde ayrı olarak kontrol edilmelidir[1,2]. Bu işlemin amacı, reaksiyon sırasında primerlerin DNA’ya bağlanma sıcaklıklarının birbirine uyumlu olmasını sağlamak ve primerlerin kendi içerisinde dimerize olmasını engellemektir[1,2]. Bu PCR tekniği genellikle viral, bakteriyel ya da diğer bulaşıcı ajanların tespiti için kullanılmaktadır[1].


Hedeflenmemiş DNA bölgelerinin çoğalmasını engellemek amacıyla kullanılan yuvalanmış PCR (nested PCR) çeşidinde, art arda iki primer setinin bulunduğu iki PCR gerçekleştirilmektedir. İlk primer seti hedef DNA bölgesini içeren ancak özgün olmayan PCR ürünlerini oluşturmaktadır. İkinci primer seti ise, ilk PCR sonucu oluşturulmuş olan PCR ürünlerini DNA kalıp olarak kullanır ve ikinci özgün primer seti sayesinde hedef DNA kısmının çoğaltımasını sağlamaktadır. Bu yöntem istenmeyen DNA bölgelerinin çoğaltılmasını engellemek için kullanılmaktadır. Ancak spesifik olmasına rağmen, primerlerin dimerize olma şansı yüksektir. Bu sebeple primerlerin validasyonu reaksiyon öncesi mutlaka kontrol edilmelidir[1,2].


Gerçek zamanlı PCR’da çoğaltılmış olan DNA’nın analizi reaksiyon sırasında yapılmaktadır. Böylece, PCR sonrası agaroz jel elektroforezine gerek yoktur. Gerçek zamanlı PCR, hedef DNA bölgesine spesifik olmayan floresan boyalar (SYBR Green) ve diziye özgün olarak tasarlanan problar (Taqman vb.) sayesinde kantitatif ve kalitatif olarak gerçekleştirilebilmektedir. Floresan boyalar, PCR sonucunda oluşan hedef DNA zincirine bağlanarak floresan açığa çıkarmaktadır. Hedef DNA’lar için tasarlanmış problar üzerinde floresan ışıması yapan haberci molekül (reporter) ile beraber ışımasını engelleyen bir söndürücü molekül (quencher) bulunmaktadır. Primer bağlandıkan sonra Taq polimerazın bu DNA zincirine bağlanması sonucun da floresan engelleyici molekül ayrılarak haberci molekülün ışıması gerçekleşmektedir. Bu sayede PCR sonucu çoğalan hedef DNA moleküller gerçek zamanlı olarak tespit edilebilmektedir[3,4].


Geri transkripsiyon PCR (reverse transcription PCR) iki aşamalı olarak gerçekleşmektedir[4]. İlk aşamada, başlangıç materyali olan mesajcı RNA (mRNA) geri transkriptaz enzimi sayesinde tamamlayıcı DNA’ya (complementary DNA, cDNA) çevrilmektedir[4]. Daha sonra bu cDNA PCR reaksiyonu için kalı olarak kullanılmakta ve PCR aşamaları gerçekleştirilerek istenen DNA bölgesi çoğaltılmaktadır. Bu PCR sonucu elde edilen PCR ürünleri agaroz jel elektroforez yöntemi ya da floresan boyalar analiz edilebilmektedir[1,2].





Referanslar

  1. Rajalakshmi, S. (2017). DIFFERENT TYPES OF PCR TECHNIQUES AND ITS APPLICATIONS. International Journal of Pharmaceutical, Chemical & Biological Sciences, 7(3).

  2. Querci, M., Jermini, M., & Van den Eede, G. (2006). The analysis of food samples for the presence of genetically modified organisms. Training course on, 33.

  3. ERCAN, Ş., & YAYLIM, İ. Gen Anlatımının Kantitatif Analizi “Real-time PCR”. ÜCD Güncelleme Serileri, 43.

  4. Bustin, S. A. (2000). Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of molecular endocrinology, 25(2), 169-193.


62 görüntüleme0 yorum