Sentetik Tohum Üretimi ve Örnek Çalışmalar
Zeynep SALGIN – Biyoloji/ Yüksek Lisans, Fen Bilimleri Enstitüsü, Aydın Adnan Menderes Üniversitesi
Tohum, bitkilerde yeni bir birey oluşturabilme ve döllenme sonucu oluşan, yapısal olarak embriyo, endosperm ve testa’dan oluşan bir moleküler yapıdır. Sentetik tohum ise ilk olarak 1950’li yıllarda bitki doku kültürü çalışmalarında araştırılmış ve çalışılmıştır. Bitki doku kültüründe kallus yapısından ‘’somatik embriyo’’ diye isimlendirilen embriyo ya da embriyo benzeri biyolojik oluşumların gelişmelerini bilim insanları gözlemlemiştir. Daha sonra bu somatik embriyoların gelişimsel süreçlerinin zigotik embriyolardakine benzer olduğunu keşfetmişlerdir. Dolayısıyla bazı laboratuar çalışmalarıyla birlikte artık bu tohumlar sentetik tohumlara dönüştürülebilirliği kanıtlanmıştır. İlerleyen tohum çalışmaları ile de sentetik tohumlar yaş tohumlar ve kuru tohumlar olarak ikiye ayrılmıştır. Farklı yöntemler ile yine bu sentetik tohum çalışmaları özellikle endemik bitkilerin yahut birçok tohum üretim çalışmalarına büyük ölçüde olumlu katkılar sunmasıyla verimli tohum eldesi oluşturulmuştur. Aynı zamanda bu yöntem transgenik bitki üretimi içinde önem kazanmıştır. Bu sayede bitkilerin elit genotiplemelerinin saklanılması ve aynı şekilde hibrit bitkilerinde somatik çoğaltımda kullanılması da gelişmiştir. Nesli tehlikede olan türlerinde germplasmlarının ve kurumayan tohum özelliği taşıyan tropik türlerinde çoğaltılıp nesli korumaya almakta da somatik embriyo ve sentetik tohum çalışmaları temel alınmıştır.
Sentetik tohum oluşum şekli, ex-vitro yahut in-vitro koşullar sağlandığında yeni bir nesil bitki oluşturabilme yeteneği olan ve depolanabilme özelliği kazanmış somatik embriyo, sürgün tomurcuğu veya da bir bitkinin dokusunun yapay bir şekilde kaplanma durumuna sentetik tohum adı verilmektedir. Daha kısa bir tanım ile bunu açıklamak istersek eğer, kallus dokusundan ya da dokularından elde edilen materyal ile yeni bir embriyoya; somatik embriyo denilmektedir. Somatik doku hücrelerine öncelikle yüksek miktarda oksin (genellikle 2,4- diklorofenoksi asetik asit (2,4-D), pikloram, NAA, gibi bitki büyüme düzenleyicilerinin bulunduğu ortamlara alındıktan sonra oksin içermeyen kültür ortamına aktarılır ve embriyo üretim yeteneği üzerinde araştırmalar yapılmaktadır[1].
Somatik embriyogenesis genel olarak Direkt Somatik Embriyogenesis ve İndirekt Embriyogenesis olarak ikiye ayrılmaktadır. Direkt embriyogenesis de yapılan uygulama eksplant üzerinde var olan hücrelerde kallus aşaması olmadan meydana gelen embriyolar iken kallusdan değil de eksplant hücrelerinden oluşmaktadır. İndirekt embriyogenesis de ise somatik embriyolarda oksin düzenleyicisinin bulunduğu ortamlardaki ekplanttan meydana gelerek embriyoların kallustan oluşturduğu durumdur. Kallus aşamaları burada var olurken somatik embriyolarda varyasyon oluşma ihtimali de çok yüksektir. Kullanım alanları olarak somatik embriyo; sentetik tohum üretiminde, klonal olarak çoğaltım işlemlerinde, endemik türlerin çoğaltımı yahutta tohum verimliliği çalışmalarının hızlandırılması ve yüksek seviyede tohum üretimi çalışmalarında kullanılmaktadır. Sentetik tohum çalışmalarını etkileyen birçok faktör bulunsa da bunlardan başlıca öne çıkanları ise; kullanılan bitki tohum örneğinin genotipi, kullanılan eksplant kaynağı, besi ortamlarının içerikleri ve inkübasyon koşullarının olumsuz durumları örnek gösterilebilir[2].
Şekil 1: Sentetik Tohum Çalışma Düzeneği[2].
Sentetik Tohum Çalışmaları
Günümüze kadar ki yapılan sentetik tohum çalışma örneklerinde ise birçok bitki örneği kullanılmış ve başarılı sonuçlar elde edilmiştir. Gupta ve Duran (1987) de Pinus taeda L. de ki (Norveç Ladini) embriyolardan ekplantlarında MS kültüründe somatik embriyo başarılı şekilde elde edilmiştir. Çalışma içeriğinde %1’lik sodyum aljinat ve elde edilen somatik embriyo damlacıkları ile 100 mM kalsiyum nitrat içinde 8-10 dk bekletilmeye uğratılmıştır. Elde edilen tohumlar saklanmış ve Gupta vd. (1987) de yine likit nitrojen kullanılarak yapılan dondurarak saklama yöntemi kullanılarak somatik poliembriyonik kitlelerdeki değişiklikleri incelemiştir.
Castillo vd. 1998 de yaptığı çalışmada Carica papaya L de 2 mm lik bir çaptaki somatik embriyo çalışmasında sıvı yoğunluğu fazla olan MS ortamlarında üretildikten sonra yalnızca %2.5 sodyum aljinatlı kaplanmış şekilde üretilmiştir. Kapsüller şeklinde besin tuzlarındaki var olması ya da olmaması, sodyum aljinat konsantrasyonu ve kalsiyum klorür ile beraber bekletilme süreleri ile bunlardan yeni yavru bitkiler elde edilmesini etkileyici belirteçlerdir. Yani %2.5 luk sodyum aljinat ve MS tuzları ile beraber kalsiyum klorür de eklenerek besi ortamı oluşturularak 10 dk bekledikten sonra en yüksek seviyede çimlenme oranı %77 olarak bulunmuştur[3].
Mamiya ve Sakamato nun 2001 de yaptığı çalışma sonucunda elde ettiği verilerde ise Asparagus officinalis L. de ön kapsülasyon işlemlerinin yapılmadan elde edilen sentetik tohumların ekilmesi sonucunda çimlenme olmamıştır. Burada bilinmesi gereken bitki büyüme düzenleyicilerinin ön kapsülasyon basamağında kullanılmamasıdır. Somatik embriyolarda kısa köklenme olduktan sonra kapsülasyon işlemi uygulanabilir. Bu elde edilen embriyolar toprak ekimi yapıldığında %72 oranında çimlenme gözlemlenmektedir.
2003 yıllarında yine yapılan somatik embriyo çalışmasında İpekçi ve Gözükırmızı nın ekonomik anlamda önemi olan bir türün (Paulonia elongata) çoğaltım yapıldığı araştırmada öncelikle tercih edilen yaprak ve internodal bölgelerinden aldıkları bitki materyallerinde direkt somatik embriyogenezi başarılı şekilde gerçekleştirmişlerdir. Bir haftalık süreçte globular evrelerin gözüktüğü ve olgun embriyoların daha sonra MS17 ortamına aktarıldığı bilinmektedir. Olgunlaşmış embriyoların daha sonra %3 lük sodyum aljinat kullanımı 50 mM ve kalsiyum klorür 2 de yarım saatlik bekletilme işlemi uygulanmıştır. Soğuk ortamda saklanmaya uygun olmayan kapsüllerdeki embriyolar %53.3 oranında bir çimlenme oranı gösterirken 30-60 günlük saklanan embriyoların çimlenme oranları ise %43.2 ve %32.4 olarak belirlenmiştir[4].
Soneji vd. 2002 deki yaptığı çalışmalarda ananas bitkisinde somatik embriyo çalışması yapmıştır. Ananas comosus L.Merr.’de dormant bölgesinden yan tomurcukları üzerinden çok sayıda püskül elde edilerek 2-5 mm lik sürgün uçlar püskülden ayrılır ve %3’lük sodyum aljinat içerisine aktarılmıştır. Daha sonra bu kapsüller 40 derecede 45 güne kadar saklanılmak için ayrılmıştır. Bu yeni yöntem denilerek ananas bitkisinde sentetik tohum çalışması başarılı şekilde denenmiş ve üretim gerçekleşmiştir.
Sawara servi ağacında yapılan somatik embriyo deneyinde ise Maruyama ve arkadaşları 2003 yılında başarılı bir deney sonucu elde etmişler ve Woody Plant (WP) ortamında araştırmalarını gerçekleştirmişler, daha sonra %2’lik sodyum aljinat damlalarını %1.4’lük kalsiyum klorid içinde damlatılarak sentetik tohum üretmişlerdir. Deney sonucunda steril ortamda bulunan embriyolar ile bulunmayan embriyoların bitkiye dönüşüm oranları ise %60 ve %100 oranında kanıtlanmıştır.
Tatlı biber üzerinde yapılan 2004 yılındaki bir çalışmada klasik bir hibrit tohum üretme süreci uzun solukludur. Yapılan çalışmada Phonkajornyord vd. nin F1 dölleri steril oluşturulmuş ve özgün genotipleri çoğaltma işlemlerinde sentetik tohum üretimi denenmiştir. Çalışmada zigotik embriyo kültürlerinden oluşturulan, nodular e sarı renkli kalluslar sıvı bir MS ortamına aktarılarak torpedo evrersine gelene kadar somatik embriyo evresini gerçekleştirmişlerdir. 20 gün boyunca 0.5 mg/I ABA ile muamele gören somatik embriyolar %3’lük sodyum aljinat ile kaplanma işlemine tabii tutulmuştur. Bu çalışmadaki çimlenme oranı ise %58 iken diğer kurutulmaya maruz bırakılan embriyolarda çimlenme oranı ise %40 olarak bulunmuştur.
Ağaç gibi yüksek evrimsel süreç geçiren türlerde ise somatik embriyo çalışmaları diğer bitkilere nazaran daha yüksek ve titiz bir araştırmayı gerektirmektedir. Özellikle bu çalışmalar üretimi zor olan ağaç türlerinde ümit verici nitelik taşımaktadır. Örneğin Pinus patula ağaçlarındaki vejetatif sürgün parçalarının kullanılarak somatik embriyo çalışmalarında çimlenmelerdeki kapsülasyon işlemlerinde sodyum aljinat konsantrasyonlarının çok önemli olduğu kanıtlanmış, kalsiyum klorür2 de bekleme mühletinin önemi vurgulanmıştır. En verimli çimlenme oranları ise %89 ve sodyum aljinat %2.5 lik bir oran ile ve 5 dakika bekleme süresinde elde edilmiştir. Yine 20 derecede 120 gün depolama süresi içerisinde herhangi bir çimlenmede düşme oranı yaşanmamıştır[5].
Gray 1987 de ki bir çalışmada Dactylis glomerata türünde somatik embriyolardaki tohum kuruma işlemlerinde yeterli düzeyde verimlilik almadığını görmüştür ve %13 lük bir nem oranı oluşuncaya kadar kurutmaya tabii tutmuştur. Kurutulan bu embriyoların büyüklüklerinde azalmalar meydana gelmiştir ve sarı renkli, kırılgan bir yapı elde etmişlerdir. Embriyoların dış duvarlarında çökme oluşmuş ve 15 dakikada yeniden şişirilmiştir, bu işlemden geçemeyen embriyolar ise normal büyüklüklerine kısa zamanda başarılı şekilde ulaşmışlardır[6].
Kapsüllerin hazırlanma aşamasında kullanılan malzemelerin farklılıkları depolanma işlemlerinde oldukça zor gerçekleşmektedir. Bu işlemin zorluk nedenleri arasında ise kapsüllerin içinde embriyoların solunum yapabilmesi ve ilaveten nemli ortamlarda saklanmazsa eğer kapsüllerin hızla kurumaya başlaması gelmektedir. Bunlara ek olarak bu kurumaları önlemek için yine içerisinde hidrofobik membran bulunan kaplanma işlemleri uygulanırken bundan ayrı eczacılık sektöründe kullanılan ilaç kapsüllenme işlemlerinde de yine bu embriyoların yerleştirilmesiyle Dupuis ve ark, 1994 yıllarında sentetik tohum çalışmaları yapmışlardır ve %90 gibi bir başarı oranı sağlamışlardır[7].
Referanslar:
1. Emek, Y. (2010). Rhaponticoides mykalea (Hub.-Mor.) MV Agab. ve Greuter'nın in vitro koşullarda çoğaltılması ve bu süreçlere etki eden faktörlerin araştırılması.
2. Çölgeçen, H., & Toker, M. C. (2006). Sentetik tohum.
3. Erdem, M., & UYSAL, H. Sentetik tohum. Frontiers in Life Sciences and Related Technologies, 2(2), 68-74.
4. Alp, H. A. (2020). Türkiyede yetişen bazı sıklamen türlerinin yumrularında somatik embriyogenesis ve sentetik tohum üretimi araştırmaları.
5. Bayraktaroğlu, M. (2012). Ayçiçeği bitkisinde (Helianthus annuus L.) bitki regenerasyonu optimizasyonu (Master's thesis, Fen Bilimleri Enstitüsü).
6. Yılmaz-Gökdoğan, E., & Ergun, K. A. Y. A. (2017). Bitki Biyoçeşitliliğinin Kısa, Orta Ve Uzun Süreli Korunması: Biyoteknoloji Ve Kriyoprezervasyon. Mustafa Kemal Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 22(1), 87-111.
7. Doğmuş, D., & Durucasu, İ. (2013). Keten Tohumu Çeşitlerinin N-Bütanol Fraksiyonlarının Fenolik Bileşenlerinin Antioksidan Aktivitesi-Antıoxıdant Actıvıty Of Phenolıc Components From N-Butanol Fractıon Of Flaxseed Varıetıes. Celal Bayar University Journal Of Science, 9(1), 47-56.