Tek Hücreli RNA Dizileme: Single Cell RNA Sequencing (ScRNAseq)
Cem HAZIR - Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans
Total RNA (bulk RNA) dizileme, son yıllarda doku düzeyindeki gen ifade seviyelerini incelemek için yaygın olarak kullanılan teknolojilerden biridir. Total RNA dizileme analizleri geleneksel olarak heterojen olarak bir arada bulunan hücre popülasyonundaki transkript seviyelerini ölçmekte ve bir hücre popülasyonundaki ortalama transkript seviyesinin ortaya çıkarılmasına imkan sağlamaktadır. Örneğin, incelenen kanser dokusunun total RNA dizileme sonuçlarında kanserli dokuda yer alan tümör hücreleri, bağışıklık hücreleri, fibroblastlar ve endotelyal hücreler dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinden gelen transkriptler analiz edilmektedir. Bu tür heterojen hücre popülasyonlarının transkriptom durumlarını tam olarak anlayabilmek için tek hücreli RNA dizileme tekniklerine ihtiyaç duyulmaktadır[1].
Tek hücreli RNA dizilemesinin (scRNA-seq) ortaya çıkışı, tek hücre düzeyindeki gen ifadesi profillerini keşfetmek amacıyla öne çıkarak önem taşımaktadır. Son yıllarda gerçekleştirilen çalışmalarda hücre heterojenitesi ve erken embriyonik gelişim süreci ile ilgili temel biyolojik soruları incelemek için uygun bir yöntem haline gelen tek hücreli RNA dizileme teknolojisinde, hücrelerin ayrıştırılması en önemli adımdır. Çünkü bu adımın koşulları hücrelerin moleküler profillerini doğrudan etkilemekte, bu süreçte meydana gelen stres ve hasarın etkisi hücre tipine göre değişkenlik gösterebilmektedir. Tek hücre popülasyonundaki transkript seviyelerini ölçmek için, çok az miktarlarda bulunan RNA'dan ters transkriptaz (RT) yöntemi ile barkodlanan cDNA amplifikasyonu gerçekleştirilmektedir (Şekil 1).
Son yıllarda, scRNA-seq özellikle çeşitli insan dokularına (normal ve kanser hücreleri dahil) uygulanmış ve bu çalışmalar gen ifadesinin hücre tipinden hücre tipine anlamlı seviyede değişkenlik gösterdiğini ortaya koymuştur [2-4]. İmmünoloji, gelişim biyolojisi ve onkoloji gibi çeşitli araştırma alanlarında tek hücreli RNA dizileme çalışmaları gerçekleştirilmiş, Tirosh ve arkadaşları, tümör ekosistemi ile ilgili ilk büyük ölçekli scRNA-seq çalışmasını 19 farklı melanom hastasından izole edilen CD45+ ve CD45- hücreleri ile gerçekleştirerek, her hastada bulunan immünoterapi hedefi olabilecek zayıf T hücre gruplarını ortaya çıkarmayı başarmıştır [5-7]. Normal ve kanserli hücrelerde gerçekleştirilen tek hücreli tam genom dizileme, genetik heterojenliğin aydınlatılmasını sağlayarak normal ve kanserli hücrelerde ortaya çıkan rastgele de novo mutasyonları analiz etmek için de kullanılmaktadır[8]. Ayrıca, tek hücreli RNA dizileme yöntemi, daha önce hiç bilinmeyen bir hücre popülasyonu içerisindeki nadir hücre gruplarını ortaya çıkarabilmektedir. Örneğin, akciğerde iyonositler (ionocytes) adı verilen nadir ve özelleşmiş hücrelerde CFTR'ın (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) ifade edildiği 2018 yılında ortaya çıkarılmıştır [9]. Yapılan diğer çalışmalar insan karaciğerindeki, bağışıklık sistemindeki ve fare ince bağırsağında bulunan bağışıklık hücrelerinin çeşitliliğini ortaya çıkarmıştır [10-12].
Şekil 1: Mikroakışkan teknolojisini kullanarak tek hücreli transkriptomik verilerin üretilmesi [13].
Dizileme tekniklerinin gelişmesi ile birlikte araştırmacılar scRNA-seq için çeşitli yöntem ve platformları kullanmaktadır. Platforma bağlı olarak sınırlı sayıda hücre yakalama veya çok sayıda dizilemenin okunmasının gerekliliği gibi sorunlar oluşabilmekte, araştırıcılar gerçekleştirecekleri deney planına uygun olan en doğru platforma karar vermektedir. Şu anda mevcut olan scRNA-seq protokolleri, yakalanan transkript kapsamına göre temel olarak 2 kategoriye ayrılmaktadır: i) tam uzunlukta transkript dizileme (full-length transcript sequencing approaches) yaklaşımları (örneğin; Smart-seq2, MATQ-seq, SUPeR-seq); ve ii) 3' ucu dizileme (transcript sequencing) yaklaşımları (örneğin: Drop-Seq, Seq-Well, Chromium, STRT-seq) [14-16]. Her yöntemin zayıf noktalarını bulmak ve tamamlamak için aynı örneklere farklı tek hücreli RNA dizileme yöntemleri uygulanmaktadır. Total RNA dizileme yöntemlerine kıyasla tek hücreli RNA dizileme yöntemi teknik açıdan gürültülü ve değişken veriler üretmekte, ortaya çıkan yüksek gürültü nedeniyle sağlam ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kalite kontrolünün yapılması gerekmektedir.
Tek Hücre İzolasyonu
Tek hücreli RNA dizileme yönteminin ilk adımı tek hücre popülasyonunu homojen olarak izole etmektir. Floresan ile aktive edilen hücre sınıflandırılması (FACS), mikromanipülasyon, lazer yakalayıcı mikro diseksiyon (LCM), mikroakışkanlar kullanılan yöntemlerden bazılarıdır. Mikroakışkanlar ve FACS yöntemi verimliliği yüksek olan iki yöntemdir ve tek hücreli RNA dizileme çalışmalarında sıklıkla kullanılmaktadır[17,18].
Tek hücreli RNA dizileme teknolojilerindeki son gelişmelerde, gerçekleştirilmiş olan tek hücreli dizileme sonuçlarının kombinasyonlarından yararlanılmaktadır. Tek hücreli kombinatoryal indekslemenin uygulanması (sci), izole edilen tek hücre popülasyonundaki açık kromatin durumu ve RNA profillerinin eş zamanlı analizine izin vermektedir [19]. Tek hücreli genomik (single-cell genomics) alanı, geliştirilen yeni teknolojiler sayesinde çeşitli hastalıklarda rol oynadığı bilinmeyen hücre gruplarının ortaya çıkarılmasına, bu nedenle yeni tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesine imkan sağlayacaktır.
Referanslar
1. Kashima ve ark. Single-cell sequencing techniques from individual to multiomics analysis.
2. Cao, J., Packer, J.S., Ramani, V., Cusanovich, D.A., Huynh, C., Daza, R., et al. (2017). Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science 357, 661-667.
3. Rosenberg, A.B., Roco, C.M., Muscat, R.A., Kuchina, A., Sample, P., Yao, Z., et al. (2018). Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding. Science 360, 176-182.
4. Chen, G., Schell, J.P., Benitez, J.A., Petropoulos, S., Yilmaz, M., Reinius, B., et al. (2016a). Single-cell analyses of X Chromosome inactivation dynamics and pluripotency during differentiation. Genome Res 26, 1342-1354.
5. Chen, H., Ye, F., & Guo, G. (2019). Revolutionizing immunology with single-cell RNA sequencing. Cellular & molecular immunology, 16(3), 242–249.
6. Cha, J., Lee, I. Single-cell network biology for resolving cellular heterogeneity in human diseases. Exp Mol Med 52, 1798–1808 (2020).
7. Tirosh I., Izar B., Prakadan SM., Wadsworth MH., Treacy D., Trombetta JJ, … Garraway, LA. (2016). Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single-cell RNA-seq. Science (New York, N.Y.), 352(6282), 189–196.
8. Zhang L., Dong X., Lee M., Maslov AY, Wang, T, Vijg J. (2019). Single-cell whole-genome sequencing reveals the functional landscape of somatic mutations in B lymphocytes across the human lifespan. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 116(18), 9014–9019.
9. Plasschaert, L. W., Žilionis, R., Choo-Wing, R., Savova, V., Knehr, J., Roma, G., ..., Jaffe, A. B. (2018). A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature, 560(7718), 377–381.
10. MacParland, S. A., Liu, J. C., Ma, X. Z., Innes, B. T., Bartczak, A. M., …, McGilvray, I. D. (2018). Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinct intrahepatic macrophage populations. Nature communications, 9(1), 4383.
11. Stubbington, M., Rozenblatt-Rosen, O., Regev, A., & Teichmann, S. A. (2017). Single-cell transcriptomics to explore the immune system in health and disease. Science (New York, N.Y.), 358(6359), 58–63.
12. Haber, A. L., Biton, M., Rogel, N., Herbst, R. H., Shekhar, K., Smillie, C., …, Regev, A. (2017). A single-cell survey of the small intestinal epithelium. Nature, 551(7680), 333–339.
13. Rich-Griffin, C., Stechemesser, A., Finch, J., Lucas, E., Ott, S., & Schäfer, P. (2020). Single-Cell Transcriptomics: A High-Resolution Avenue for Plant Functional Genomics. Trends in plant science, 25(2), 186–197.
14. Chen, G., Ning, B., & Shi, T. (2019). Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis. Frontiers in genetics, 10, 317.
15. Sheng, K., Cao, W., Niu, Y., Deng, Q., & Zong, C. (2017). Effective detection of variation in single-cell transcriptomes using MATQ-seq. Nature methods, 14(3), 267–270.
16. Macosko, E. Z., Basu, A., Satija, R., Nemesh, J., Shekhar, K., Goldman, ..., McCarroll, S. A. (2015). Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell, 161(5), 1202–1214.
17. Hwang, B., Lee, J. H., & Bang, D. (2018). Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & molecular medicine, 50(8), 1–14.
18. Gross, A., Schoendube, J., Zimmermann, S., Steeb, M., Zengerle, R., & Koltay, P. (2015). Technologies for Single-Cell Isolation. International journal of molecular sciences, 16(8), 16897–16919.
19. Cao, J., Cusanovich, D. A., Ramani, V., Aghamirzaie, D., Pliner, H. A., Hill, A. J., ..., Shendure, J. (2018). Joint profiling of chromatin accessibility and gene expression in thousands of single cells. Science (New York, N.Y.), 361(6409), 1380–1385.