Virüsler En Çarpıcı Parazitlerdir
Nurhayat Kayar - Biyoloji Öğretmeni, Baksan Mesleki Eğitim Merkezi
Mikroskobik patojenlerin hepsi hücrelerden oluşmazlar. En iyi bilinen hastalık sebebi diğer organizmalar virüsler olup bunlar enfekte ettiği hücrenin iç düzeneğini kullanarak kendi kopyalarını üretirler. Virüslerin sebep olduğu hastalıklar çeşitli olup hepsi de oldukça yaygın tanınır: suçiçeği, grip, zatürrenin bazı tipleri, kızamık, kuduz, sarılık, nezle ve daha birçoğu. Bir zamanlar dünyanın baş belası olan çiçek hastalığı, 1960’ların ortalarında dünya genelindeki bir çaba ile 10 yıllık bir aşılanma süreci sonucunda yeryüzünden silinmiştir. Bitkilerdeki viral enfeksiyonlar (ör. bodur mısır mozaik virüsü ) büyük ürün kayıplarına sebep olur. Geleneksel ıslah ve son zamanlarda genetik mühendislik yöntemleri ile geliştirilen virüs-dirençli varyetelerin ekimi bu ürün kaybını önemli derecede azaltabilir. Virüslerin çoğu sınırlı bir konakçı yelpazesine sahip olup, sadece bazı bakteri, bitki veya hayvanları enfekte edebilirler[1].
Virüsler kendi başlarına büyüyüp çoğalamadıklarından, bu bağlamda canlı kabul edilmezler. Yaşamak için bir virüs bir hücreyi enfekte etmeli ve onun iç düzeneğini ele geçirerek viral proteinlerini sentezlemeli ve bazı durumlarda viral genetik materyalini çoğaltmalıdır. Yeni yapılan virüsler tomurcuklanmayla hücre zarından ayrıldıklarında veya enfekte ettikleri hücrenin parçalanması sonucu ortama salındıklarında yeni bir enfeksiyon döngüsü başlar. Tipik bir virüs, daha çok virüs üretmek için üzerinde bilgi taşıyan genetik materyalin etrafında bir protein kılıf taşır. Kılıf, bir virüsü çevresine karşı korur ve onun spesifik konakçı hücrelere yapışmasına veya girmesine yardımcı olur. Bazı virüslerde protein kılıf zarf benzeri dış zarla çevrilidir[1].
Şekil 1: Büyümek ve çoğalmak için virüsler konakçı bir hücreyi enfekte etmelidir. Bu elektron mikrograflar virüsler tarafından sergilenen bazı yapısal çeşitlilikleri göstermektedir[1].
Virüslerin kendi genetik materyallerini hücre ve dokuların içine taşıma yeteneği hem tıbbi bir sorun ve hem de bir fırsat sunar. Hücreleri parçalayıp dokuları tahrip ettiklerinden, viral enfeksiyonlar çaresiz ve yıkıcı olabilir. Ancak, hücre manipülasyon metotlarının çoğu genetik materyali hücre içine sokmak için virüsleri kullanmaya dayanır. Bunu yapmak için, viral genetik materyalin potansiyel olarak zararlı kısmı insan genleri dahil diğer genetik materyalle yer değiştirilir. Bu şekilde değişikliğe uğratılmış virüsler veya vektörler hala hücreye girebilir ve taşıdıkları genleri beraberinde götürebilirler. Bir zaman gelecek ki bozuk bir genle ortaya çıkan bir hastalık, ilgili genin sağlam kopyasının viral bir vektörle aktarılması ile tedavi edilebilecektir. Son araştırmalar, bu yaklaşımın önündeki büyük zorlukların üstesinden gelmeye adanmıştır[1].
Virüslerle Gen Terapisi
Adeno ilişkili virüslerden (AAV) türetilen vektörler, gen terapisi çalışmalarında yaygın olarak kullanılır, çünkü birincil olarak vahşi tip AAV herhangi bir patojenite ile ilişkili değildir, vektörler tipik olarak düşük immünojeniteye sahiptir ve bölünmeyen hücrelerde uzun yıllar boyunca transgen ekspresyonunu koruyabilir[2]. DNA yapısına genetik mühendisliği teknikleri kullanılarak belirli özel gen dizilerinin aktarılması işlemine gen transferi denir.Yabancı bir genin bu teknikler kullanılarak genoma eklenmesiyle transgenik hayvanlar elde edilmektedir.
Vektörler, bir AAV virüsünden, çoğaltma için gerekli olanlar da dahil olmak üzere tüm viral genlerin çıkarılmasıyla oluşturulur, böylece ortaya çıkan vektörler, konakçı DNA'ya önemli bir frekansta replike olamaz veya entegre olamaz. Bu nedenle, tek sarmallı vektör, esas olarak transfekte hücrelerde bir epizom(plazmid) olarak bulunur. Düzinelerce AAV serotipi (çeşidi)tanımlanmış ve laboratuvarda birçok yeni form oluşturulmuştur. Farklı AAV serotiplerinden türetilen vektörler, farklı doku tropizmine ve transfeksiyon etkinliklerine sahiptir. Bununla birlikte, tüm AAV vektörleri, yaklaşık 5 kb'lik nispeten küçük bir paketleme kapasitesine sahiptir. Mesela DMD( Duchenne musküler distrofi) fonksiyonel bir distrofin proteini üretememe ile sonuçlanan distrofin genindeki bir mutasyondan kaynaklanır. Genden üretilen protein ve transkriptin büyük boyutu, DMD'nin gen terapisi için yöntemler geliştirmenin önünde büyük bir engel olmuştur. Bununla birlikte, hem hayvan modellerinde hem de klinikte yapılan çok sayıda çalışma, distrofinin yapısal alanları hakkında önemli bilgiler üretmiştir ve gen terapisi uygulamalarına daha yatkın olan oldukça işlevsel mini ve mikro distrofinlerin rasyonel tasarımını sağlamıştır . Özellikle, minyatürleştirilmiş "mikro distrofinlerin" geliştirilmesi, AAV vektörleri kullanılarak yapılan erken faz klinik deneylerde hayvan modellerinde distrofik kaslara terapötik kasetlerin verilmesini sağlamıştır . Son on yılda çeşitli laboratuarlar tarafından çeşitli fonksiyonel mini distrofinlerin geliştirilmesine rağmen, ideal bir gen terapisi formu, tam uzunluktaki distrofin geninin veya cDNA'nın verilmesini veya onarımını mümkün kılacaktır. Bununla birlikte, bugüne kadar yetişkin memelilerin kaslarına vücut çapında veya 'sistemik' bir şekilde yeni genler verebildiği gösterilen tek vektör AAV olmuştur. Sonuç olarak, daha büyük veya hatta tam uzunlukta distrofin cDNA'ları verme çabaları, tam kodlama dizisini, birçok AAV vektörü tarafından teslim edildikten sonra in vivo olarak daha büyük bir klon halinde yeniden oluşturulabilen parçalara bölme etrafında dönmüştür. Örneğin, 7.3 kb'lik bir kaset üzerinde kodlanan bir mini distrofinin ekspresyonu, DMD için bir hayvan modeli olan mdx farelerinin kaslarına iki AAV vektörünün birlikte verilmesi ile sağlandı. Bu yaklaşım, in vivo olarak daha küçük distrofin kasetlerinin homolog rekombinasyonu yoluyla bir mini distrofin oluşturdu ve farelerde önemli histolojik ve fizyolojik gelişmelere yol açtı. İlgili bir yaklaşım kullanılarak, tam uzunluktaki distrofin cDNA, tam uzunluktaki distrofini iki farklı birincil RNA transkriptinden gelen eksonların uç uca birleştirildiği ve bağlandığı özel bir RNA işleme biçimi olan trans-splice ve ifade etmek için tasarlanmış 3 vektöre bölünmüştür. Bu üç vektör yaklaşımı, enjekte edilen kaslarda bazı tam uzunlukta distrofin üretimini mümkün kılarken, üç vektörün de trans-splicing'in çalışması için aynı hücreyi transfekte etmesi gerektiğinden verimlilik oldukça düşüktü. Sonuç olarak, bu yaklaşım kullanılarak çok az fonksiyonel fayda gözlemlendi. İkili ve üçlü vektör yaklaşımları, bu tür yöntemlerin daha da geliştirilmesi için potansiyeli gösterirken, mikro-distrofin vektör dağıtımının verimliliği şu anda öngörülebilir gelecekte etkili bir gen terapisi için en fazla ümit vaat etmektedir. Aslında, birkaç grup halihazırda AAV / mikro-distrofinin lokal veya sistemik verilmesini içeren insan klinik deneyleri hazırlamaktadır. Hedeflenen nükleazları kullanan diğer yeni gen düzenleme teknikleri, örneğin CRISPR / Cas9, TALEN veya Zinc parmaklar, hasta DNA'sından mutasyonları onararak veya ortadan kaldırarak distrofin ekspresyonunu eski haline getirmek için umut verici yöntemler gibi görünmektedir. Bu yaklaşımın son zamanlarda DMD hastalarından kültürde ve mdx fare zigotlarında türetilen hücrelerde distrofin ekspresyonuna izin verebildiği gösterilmiştir. Hedeflenen tüm nükleuslarla, bir tanıma sekansı, nükleazların ilgili DNA sekansına lokalize edilmesine yardımcı olur ve çift iplikli bir kırılmayı indükler. Çift sarmallı kopma daha sonra ya homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) ya da homolog rekombinasyon ile sabitlenir. NHEJ için, distrofin genindeki iki çift sarmallı kırık, açık bir okuma çerçevesini geri yükleyebilir ve eksize edilmesi gereken genomik bölgenin boyutuna ve distrofin genindeki herhangi bir genomik delesyon mutasyonunun varlığına bağlı olarak hafifçe kesilmiş bir distrofin proteini ile sonuçlanabilir. Nükleazların yanı sıra, homolog rekombinasyona izin veren bir şablon sağlanabilir, bu durumda, hedeflenen allelden vahşi tipte tam uzunlukta bir distrofin üretilebilir. Bununla birlikte, homolog rekombinasyonun mitotik sonrası hücrelerde verimli bir şekilde meydana gelip gelemeyeceği belirsizliğini korumaktadır. Hedeflenen nükleazların ve şablonların sistemik uygulanmasını sağlamanın bir yolu olarak AAV vektörleri, nükleazı ve şablon dizisini iletmek için bir araç olarak kullanılabilir. Henüz yayınlanmamış olsa da, birkaç grup (bizimki dahil) son toplantılarda AAV vektörlerinin CRISPR ve Cas9 ekspresyon kasetlerini distrofik farelerin kaslarına iletmek için umut verici bir yaklaşım olabileceğini öne süren cesaret verici veriler sundu. CRISPR / Cas9 ve TALEN, DMD veya diğer nöromüsküler bozuklukları incelemek için yeni hayvan modelleri oluşturmak için de kullanılabilir[2].
Aynı zamanda gelişmekte olan fetüsünde , onu terapötik gen düzenlemesi için elverişli hale getirecek birkaç özelliği vardır. İmmünolojik olarak olgunlaşmamış; In utero gen terapisi çalışmaları, transgen ürününe tolerans ve prenatal viral vektör iletimini takiben vektöre karşı bir immün yanıtın olmadığını göstermiştir. Bu, postnatal gen terapisini takiben antikor ve T hücresi aracılı yanıtların gelişimi ile çelişir. Küçük fetal boyut, fetal ağırlık başına yüksek düzeyde vektör verilmesine izin verir. Birden fazla organın hücreleri yüksek oranda proliferatiftir ve fetal gelişim sırasında verimli vektör transdüksiyonu için erişilebilirdir. Son olarak, rahim içi düzenleme, yüksek prenatal veya perinatal morbidite ve mortaliteye sahip hastalıklar için kritik olan, hastalık başlangıcından önce genleri hedefleme potansiyeli sunar[3].
Baktığımız zaman virüslerin gen transferinde kullanılarak gen terapisi yoluyla hastalıkların tedavisinde kullanılmasıyla yeni aşamalar kaydedilmiş olup hayvan deneylerinde önemli adımlar elde edilmiştir. Virüsler doğaları gereği genomlarını insan genomuna entegre edebilmektedirler. Böylece virüslere insan genleri yüklenip bu genler virüsler tarafından insan genlerine nakledilirse eksik olan ya da patolojiyi düzelten bir protein senteziyle hastalığın tedavisi mümkün olabilecektir. Retro, adeno ya da adeno ilişkili virüsler en çok kullanılan çeşitlerdir. Ayrıca kılıf proteinleri ile oynanmış yalancı tipli virüsler de kullanılabilmektedir.
Referanslar:
1. Harvey Lodish,Arnold Berk,Chris A.Kaiser,MOnty Krieger,Mattew P.Scott, Anthony Bretscher, Hidde Ploegh, Paul Matsudaira,( 2011)Moleküler Hücre Biyolojisi,(Altıncı baskı)(Pr.Dr. H. Geçkil, Prof.Dr. H. Geçkil, Prof.Dr. M. Özmen, Prof.Dr.Ö. Yeşilada ,Çev.)Ankara: Palme Yayıncılık
2. Katrin Hollinger and Jeffrey S. Chamberlain, Viral Vector Mediated Gene Therapies,October 2015
3. Avery C. Rossidis, John D. Stratigis, Alexandra C. Chadwick, Heather A. Hartman, Nicholas J. Ahn1, Haiying Li, Kshitiz Singh, Barbara E. Coons, Li Li, Wenjian L, Philip W. Zoltick, Deepthi Alapati, William Zacharias, Rajan Jain, Edward E. Morrisey, Kiran Musunuru, and William H. Peranteau, In utero CRISPR-mediated therapeutic editing of metabolic genes, October 2018